食品中铜绿假单胞菌检测

铜绿假单胞菌
一、概 述
• 铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）俗称绿脓杆菌， 因为在代谢过程中产生水溶性的绿色色素，使伤 口与创面呈绿色，故名绿脓杆菌。 • 铜绿假单胞菌能在许多污染物质中存活并繁殖， 生长营养需求不高，善于利用各种碳源和氨化合 物作为氮源，在水、土壤、食品以及医院等环境 广泛存在，甚至在蒸馏水、消毒液也不例外，如 季铵类消毒液，特别是含有一些有机物的液体。
3、生化特性 • 氧化酶和过氧化氢酶阳性。O/F试验为氧化型， 还原硝酸盐为亚硝酸盐，分解乙酰胺产生氨。 98 ％菌株产生水溶性荧光色素。铜绿假单胞菌能 液化明胶，酪蛋白水解，但淀粉不水解。90 ％以 上的菌株产生蓝绿色色素。 • 分解蛋白质能力强，发酵糖类能力较低，氧化分 解葡萄糖，产酸不产气，不分解甘露醇、乳糖及 蔗糖，能液化明胶，分解尿素，不形吲哚，氧化 酶试验阳性，还原硝酸盐产气，靛基质阴性，不 产硫化氢。
三、致病性
• 主要致病物质是内毒素，此外尚有菌毛、荚膜、胞外 酶和外毒素等多种致病因子。可引起局部化脓性炎症 ，也可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎、胃肠炎、心内 膜炎 、脓胸，还可引起菌血症、败血症及引起婴儿严 重的流行性腹泻。 • WHO的HACCP评估明确指出铜绿假单胞菌是婴儿瓶装 饮用水的危害指示菌，可造成婴儿腹泻。尤其是抵抗 力较差的老弱病幼孕人群，饮用含铜绿假单胞菌的瓶 装水很可能导致疾病的发生，患者食入103~104个菌体细 胞即可被侵害。铜绿假单胞菌的生长还将增加亚硝酸 盐的含量-参考文献。
产荧光素实验（金氏B培养基）
• 原理：蛋白胨提供氮源，磷酸盐促进荧光素 的产生并抑制绿脓色素的产生，硫酸镁为 荧光素的产生提供必须的阳离子，琼脂是 培养基的凝固。 • 操作：将上述呈红褐色的且氧化酶反应呈阳 性的培养物接种于金氏B培养基上，于 36℃±1℃恒温箱培养24h～5d。 每天需取 出在紫外灯下检查其是否产生荧光性，将 5d内产生荧光的菌落记录为阳性。
培养基和试剂
• 假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂（低温避 光保存） • 金氏B 培养基（低温避光保存） • 乙酰胺肉汤 • 营养琼脂 • 氧化酶试剂 • 钠氏试剂（配制好之后低温避光保存）
设备和仪器
• 玻璃器具：所有玻璃器皿使用前需121℃高 压蒸汽灭菌15分钟 • 恒温培养箱：36℃±1℃ • 紫外灯：波长应为360±20nm • 滤膜：直径47mm，微孔径为0.45μｍ （处理方法：
计数结果说明
• 菌落计数公式： N＝P＋F(cF/nF)＋R(cR/nR) – P是呈蓝/绿色的菌落数（所有证实为铜绿假单胞 菌的菌落）。 – F是没有绿脓色素但显荧光的菌落数。 – R是呈红褐色的菌落数。 – nF是进行产氨测试的显荧光菌落数。 – cF是产氨阳性的显荧光菌落数。 – nR是进行产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光 测试的红褐色菌落数。 – cR是产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试 均呈阳性的红褐色菌落数。
• 举例
N=17+16×(2/5)+10×(3/5) – 17：呈蓝/绿色的菌落数； – 16：没有绿脓色素但显荧光的菌落数； – 2：产氨阳性的显荧光菌落数； – 5：进行产氨测试的显荧光菌落数； – 10：呈红褐色的菌落数； – 3：产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试均 呈阳性的红褐色菌落数； – 5：进行产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测 试的红褐色菌落数。
三、实验室检验
GB/T 8538-2008 铜绿假单胞菌检测（滤膜法）
原
理
将250mL水样用孔径为0.45μm的滤膜过滤， 并将滤膜移至CN琼脂培养基上，于36℃士1℃恒 温箱中培养48h，能够在CN琼脂上生长并产生绿 脓菌素，或者能够在CN琼脂上生长并且氧化酶呈 阳性、紫外光（360±20nm）照射下能发荧光、 能够利用乙酰胺产氨的革兰氏阴性无芽孢杆菌， 经证实为铜绿假单胞菌，则其检测结果为阳性。
产氨实验（乙酰胺肉汤）
• 原理：铜绿假单胞菌产生一种脱酰胺酶，可使 乙酰胺经脱酰胺作用释放氨，滴加钠氏试剂 （碘化汞钾），氨在碱性条件下与碘化汞钾作 用，生成红色的络合物。
• 操作：将纯培养物接种到装有乙酰胺肉汤的试 管中，在36℃±1℃下培养20h～24h。然后向 每支试管培养物加入1～2滴钠氏试剂，检查各 试管的产氨情况，如表现出从深黄色到砖红色 的颜色变化，则为阳性结果，否则为阴性。
国内外污染情况- 参考文献
• 国内污染情况：
-瓶装天然矿泉水铜绿假单胞菌的检出率1.2％～23.6％； -瓶装饮用纯净水铜绿假单胞菌的检出率11.6％。 • 国外污染情况： -Richards等在104件检品中的4件分离到铜绿假单胞菌； -Rosenberg报告德国1.2％～10.2％的瓶装矿泉水检出铜 绿假单胞菌。 • 刚出厂的产品中铜绿假单胞菌数量较少，但有文献报 道5加仑桶装产品（15～31天的保存期），铜绿假单胞 菌可生长繁殖达到 CFU/ml。 • 国内卫生标准：0 CFU/250ml
二、生物学特性
1. 培养特性 本菌属于假单胞菌属，是一种 非发酵革兰阴性无芽孢杆菌，菌体 细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或 短链状排列。菌体的一端有单鞭毛，在暗视野显 微镜或相差显微镜下观察可见细菌运动活泼。 2．菌体形态 无芽孢，无夹膜，革兰阴性杆菌，有单鞭毛 或丛鞭毛，运动活泼。菌体的大小为0.5～ 1µm×1.5～3.0µm，菌体笔直或弯曲。
纯 化
• 营养琼脂：将需验证的可疑菌落划线接 种营养琼脂培养基，于36℃±1℃培养 20h～24h，对可疑菌进行纯化。
将最初显红褐色的菌落进行氧化酶试验 • 氧化酶试验 ： • 原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统 的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧 化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的 醌类化合物。 • 操作：取2～3滴新鲜配制的氧化酶试剂滴到放于平皿里的 洁净滤纸上。用铂金丝接种环或玻璃棒，将适量的纯种培 养物涂布在预备好的滤纸上。在10秒内显深蓝紫色的视为 阳性反应。也可以按照商品化氧化酶测试产品的说明书进 行该项测试。
• 铜绿假单胞菌可由多种途径传播，但主要是通过 污染医疗器械、用具及带菌医护人员引起医源性 感染，因此，对烧伤病房、手术器械及治疗器械 应进行严格消毒灭菌，以保证无铜绿假单胞菌的 污染。对铜绿假单胞菌感染的治疗，可应用庆大 霉素、多粘菌素B和羧苄青霉素。 • 铜绿假单胞菌抵抗力较其他革兰阴性菌强， 56℃1h可杀灭，对很多抗生素具有耐受性。对消 毒剂、干燥、紫外线等理化因素及不良环境抵抗 力强，对化学药物的抵抗力比一般革兰氏阴性菌 强大。
如滤膜未经灭菌，则使用前需先将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌3次，每 次15 min。前两次煮沸后需更换水，用蒸馏水洗涤2次～3次，以除去残留溶剂。建议使用一次性无 菌滤膜。）
• 显微镜：10×～100× • 冰箱：0℃～8℃
操作步骤-水样过滤
在100级的洁净工作台进行过滤操作。 首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分， 将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上， 固定好滤器，将250mL水样或稀释液通 过孔径0.45μm的滤膜过滤，然后将过滤 后的滤膜贴在已制备好的CN琼脂平板上， 平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着 气泡。
• 样品稀释 若样品污染严重，建议对样品进行稀 释，如10倍递增稀释：取30ml样液加入 至270ml无菌生理盐水中，混匀，以此类 推，进行系列稀释。
• 报告 结果以 CFU/250ml计。
• 其他确证试验方法
自动生化鉴定仪器 生化试剂条（以国标法为参照，二者符 合率99.6％- 参考文献）
结果观察ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
培养20h～24h观察滤膜上菌落的生长 情况并计数，防止因为培养导致菌落过分 生长而出现菌落融合。（ 40h～48h时更 容易观察产色素情况和荧光情况）。
可疑菌落计数情况
• 计数所有显蓝色或绿色（绿脓色素）的菌落，初步 判定为铜绿假单胞菌。 • 计数滤膜上所有发荧光不产绿脓色素疑似铜绿假单 胞菌菌落，并进行乙酰胺肉汤确定试验。 （在紫外线下检查滤膜时，应避免长时间在紫外光 下照射，否则可能会将平板上的菌落杀灭，而导 致无法在证实培养基上生长。） • 将其它所有红褐色不发荧光的菌落进行氧化酶试验、 乙酰胺肉汤、金氏B培养基确证实验。