第10讲 蛋白质结构测定和分析 生物信息学

生物大分子三维结构研究方法：
①核磁共振波谱学 ②X-射线晶体学 ③低温电镜技术
测定生物大分子结构重要手段
具有不同结构特征的原子核间距、肽键二面角、肽键的动态特性等都具 有特征的核磁共振谱线；
1H,13C,15N是核磁共振检测的主要对象,各有不同的共振频率,从而形成核 磁共振氢谱、碳谱和氮谱三部分；
3
4
x
= /2
0
1
2
3
4
x
= -
0
1
2
3
4
x
0
0
对于一束X-射线 f(x) = A cos(2x – )来说，无论它的初始相角是多少，它在接收 屏上所形成的曝光点都是相同的。反之，我们只根据接收屏上的曝光点也是无法得 知造成该曝光点的X-射线的初始相角信息的。 初始相角无法直接测量得到，但它又是求解电子密度时所必需的信息。这就是X-射 线晶体衍射法解析物质结构时所需要解决的核心问题——相位（相角）问题。
Suspension with macromolecules
C-film
Plunge freezing in liquid cryogen (ethane, propane) Investigation in amorphous ice
低温样品转移过程，低于-170°C
Cryo-holder workstation
NMR 不破坏被测样品的内部结构，是一种无损检测方法。
核磁共振谱仪的组成
•Magnet •Probe •Console •Computer
1985 年,维特里希( Kurt Wüthrich）等人公布了第一次利用NMR 法 测定的溶液中蛋白质-蛋白酶抑制剂IIA ( proteinase inhibitor IIA) 的 结构；
(xyz)
Protein structure
Tracing & Building
Structural Refinement
Φ(hkl)
Phasing & Improvement
Initial Structural Model Computer control & data analysis
Final Structural Model
目前,科学家已经利用这一方法绘制出15 %～20 %的已知蛋白质的结构；
它已广泛应用于化学、食品、医学、生物学、遗传学等学科领域
NMR测定结构的特点
直接在溶液中测定自然状态下的大分子三维空间 结构，其分辨率已接近0.12nm ；
它只能测量分子量较小(15-25kDa)的生物分子， 最大可测定35kDa 的生物分子
生物信息学
第10讲 蛋白质结构测定和分 析
Why protein structures? 仅仅限于药物研发吗？
各种蛋白质原子结构：解释了生命的本质
细胞维持基本生命特征 适应内外环境
进化选择了一套精巧的分子机制
细胞内几乎每个生物学过程 均包含多个蛋白质相互作用
细胞：精巧的“生化工厂”
细胞是生命的基本单位
透射电子显微镜技术
负染技术
Curr Protoc Protein Sci. 2005 Dec;Chapter 17:Unit 17.2
优点 • 对比度好 • 信噪比高 • 操作简便 • 耐电子辐射
不足 • 由于脱水作用而变形失真 • 由于染色剂的pH和离子强度而变形失真 • 仅显示外围轮廓 • 成像依赖染色的质量 • 周围背景过高 • 分辨率有限
N
Refinement
Refine CTF
Box Particles
Pre-Process Images
Establish Refinement Criteria: Resolution Limits
Determine Origin and Orientation (q,f,w,x,y)
Select Images
SR X-ray source
Diffraction Data |F(hkl)|
Protein Crystal
X-射线晶体学
X-射线的产生
电子被高能设备如X射线发生器 或同步加速器从低能轨道激发跃迁到 高能轨道后，会自然衰减并回迁到低 能级轨道，在电子的减速和回迁过程 中发射出X射线。
X-射线发生方法
储存环 (storage ring)
粒子轨迹(particle trajectory)
蛋白质晶体
蛋白质晶体内部结构：三维周期重复排列，每个结晶重复 单位(分子或复合体)的化学组成与分子构象都是均一的。
Y 1mm=107埃线性尺度可以包含 Z 104-5个分子(分子尺度102-3埃)
三维尺度1x1x1mm3可以包含 1064-125个分子。
Initial 3D Model
Compute 3DR
Monitor Data Quality Y
N
Refine?
N Done?
Auto3dem
Y
Visualize & Interpret 3D Structure
Archive Data
HPV58 VLP 低温电镜结构重建
Digitize Micrograph Box Particles
透射电子显微镜技术
透射电子显微镜技术是以电子束为光源的显微成像技术， 其成像原理与普通光学显微镜基本一样，但电子束的波长比可 见或紫外光要短得多，因此其分辨率得到很大的提高，目前 TEM的分辨力可达0.2nm。
透射电子显微镜技术
电子枪
c)
样品杆
聚光镜系统 样品杆
阀门
阀门 显示屏
显示屏
仪器示意图
生物样品为什么需要低温：
脂质体负染图
脂质体冷冻电镜图
为什么需要低温：冷冻超薄切片举例
为什么需要低温：冷冻负染举例
低温样品制备 VITROBOT - VITRIFICATION ROBOT
Incubation of suspension on grid (holey carbon or Quantifoils) at constant temperature and humidity Automated blotting
Z 单位晶胞
b
c Y
X
有关结论汇总：
对称元素：10，26 空间群：230 点群：32 晶系与晶胞参数类别：7 平移群：14 空间点阵类别：P，C，I，F。
结晶常用方法
X-射线与晶体的关系
✔
只有光源波长与障碍物尺度相当，或者光源波长小于障碍物尺度的时候才能 探测到障碍物的信息。
衍射和干涉
C-C键长：1.5Å X-射线波长： λ ＝0.1Å-100Å
Specifying Direction of View: q,f,w Orientation
Z
5
3
w
q
(80,-15)
f
X
5
低温样品杆
Cryo-holder workstation
Cryo-EM 3D Reconstruction of Viruses
In theory In practice
From Lake (1972), p.174
低温电镜三维结构重建
EPU
提纯样品 速冻样品制备 样品预扫描 （负染）
低温电镜 超微图像采集
X射线
阴极(cathode)
真空
负高亚(negative high tension)
阴极的热电子在负 高压的作用下高速 撞击阳极的金属靶， 大部分能量转化为 热能，小部分能量 转换为X射线。
X-射线发生方法
同步辐射
带电粒子（electron或positron）以接近光速的速度在储存环中循环运动。当 粒子束被迫改变方向时，被朝着环心加速并发射出电磁波。
解决相位问题的方法：
❖ 同晶置换法 最原始的方法，包括多对同晶置换法和单对同晶置换法。需
要在蛋白质晶体中引入重原子，并且要求引入了重原子的晶体与 未引入重原子的晶体的晶型基本相同。解析过程需要未引入重原 子、引入了重原子，甚至引入了不同重原子的多颗晶体的多套衍 射数据。
❖ 反常散射法 包括多波长反常散射法和单波长反常散射法。通常需要引入
Technical Roadmap from gene to protein by SR X-ray crystallography
Bioinformatics
Gene sequence Biological Story
Computer control & data analysis Raw genomic data
基因/基因组 蛋白质/蛋白质组
蛋白质相互作用
细胞器 细胞
组织/器官 及以上层次
认识“蛋白质机器 及其相互作用模式” 是破译生命规律不 可或缺的重要层次
蛋白质结构测定与功能研究同步进行、甚至先行一步， 并非一定在清楚功能的前提下再开展三维结构研究。
结构 ?
功能 OK
传统的做法
结构 ?
功能 ?
现代的做法
Xplore3D
单颗粒重构 断层图像重构
wenku.baidu.com
图像整合
Localization and)
Argos
compute 3D maps from 2D images
In electron microscope
In our program
3D virus in real world
2D images
3D map in computer
X-射线+晶体
X-射线+晶体
原子核 核外电子
仅考虑核外电子的作用，忽略原子核的作用。 蛋白质晶体内部结构抽象为充满了电子云的三维空间。 晶体衍射即为以晶胞内电子云为散射体产生的相干次生波的干涉现 象
X-ray 360 °衍 射图：
晶 体 衍 射 数 据
|F(hkl)|
修正
相角问题求解
…… 各种方法获得初始相角
低温透射电子显微镜技术
速冻技术
Curr Protoc Protein Sci. 2005 Dec;Chapter 17:Unit 17.2
Physiology 21: 13-18, 2006
优点 • 将样品保留在液相中 • 维持了天然结构 • 高分辨率 • 揭示内部结构
不足 • 设备及操作要求较高 • 信噪比低
封闭的X射线管 旋转阳极X射线管
封闭的X射线管工作原理示意图
旋转阳极X射线 管的出现主要是为 了解决散热问题， 使得X射线管的工 作功率大大增加。
阳极(anode) 铍窗口
例如： 封闭X射线管：
40kV, 50mA 旋转阳极X射线管：
40kV, 200mA
发射角(take-off angle)
X射线
具有较强反常散射能力的原子，如硒原子。不需要多颗晶体但往 往需要同一颗晶体在不同波长X-射线照射下的多套衍射数据。随 着技术的进步，目前蛋白质自身的硫原子也开始被用来作为反常 散射源。
❖ 分子置换法 需要同源性较高的蛋白质分子结构模型，不需要多颗晶体，
不需要多套衍射数据，方便快捷，但不能用来解析全新的结构。
~1400 micrographs ~6000 particles
HPV58 VLP 低温电镜结构重建
Pre-Process Images
Remove blemish, Remove Gradient Normalize means/variances, Apodize
Determine CTF parameters Create Initial Parameter Files
(xyz )
1 V
|
hk l
F(hkl)
|
exp[ 2
i( hx
ky
lz)
i(hkl)]
❖ 为电子密度，xyz 为实空间坐标
k
❖ V 为晶胞体积
❖ |F(hkl)|2 = I(hkl)，I 代表衍射点的强
度，hkl 为衍射点坐标
h
❖ 代表初始相角
f(x) = A cos(2x – )
=0
0
1
2
并改善其品质
电子密度计算
最终模型
(xyz)
初始模型 Tracing
关键问题：相位解决
蛋白质分子结构，即根据蛋白质电子密度构建的分子模型。
(xyz ) 1
| F(hkl) | cos[2(hx ky lz) (hkl)]
V hkl
参考 f(x) = A cos(2x – )
上式也可表示为：
Icosahedral Particle Image Reconstruction Scheme
Expand Data Set
Icosahedral Virus 3D Reconstruction Scheme
Digitize Micrograph
Y
More Data?
Resample Rebox
O
X
晶体的产生—结晶相
影响因素：
： ❖物理因素 温度、压力、震
动、溶剂清洁度、试剂纯度、 重力、外加物理场等
： ❖生物化学因素 pH、离子强
度、沉淀剂/添加剂的类型和浓 度等
： ❖其他 溶液过饱和度、纯度
等
晶体内部结构可以抽象为称 为单位晶胞（a,b,c,α,β,γ)的
单位平行六面体的密堆积。 a