谷子SSR分子标记的研究进展_沈琰
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第 ３２ 卷 第 ３ 期 ２ ０ １ ６ 年 ３ 月
ＤＯＩ：１０．１３６５２／ｊ．ｉｓｓｎ．１００３－５７８８．２０１６．０３．０４９
OOD & MACHINERY 食品与机械
Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．３ Ｍａｒ ．２ ０ １ ６
谷子 ＳＳＲ 分子标记的研究进展
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓ ｏｎ ＳＳＲ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｆｏｘｔａｉｌ ｍｉｌｌｅｔ
基金项目：“十 二 五 ”农 村 领 域 国 家 科 技 计 划 项 目 （编 号： ２０１２ＢＡＤ３４Ｂ０２）；黑龙江省应 用 技 术 与 开 发 重 大 项 目 （编 号 ：ＧＡ１４Ｂ１０４）
作 者 简 介 ：沈 琰 ，女 ，黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 在 读 硕 士 研 究 生 。 通讯作者：张东杰（１９６６－），男，黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 教 授，博 士，博
谷子亦称粟米，是 最 早 起 源 于 中 国 的 重 要 杂 粮，迄 今 已 有８ ７００年的栽培史［１］。谷 子 属 禾 木 科 狗 尾 草 属 作 物 ，具 有 生育期短、耐旱、耐瘠等生理特性，广 泛 分 布 于 亚 欧 大 陆 的 温 带和热带，是中国黄河中上游地 区 主 要 栽 培 作 物 之 一［２］。 同 时，谷 子 营 养 价 值 极 高，含 有 丰 富 的 氨 基 酸、蛋 白 质、维 生 素
沈 琰１ 王 颖１，２
孙 大 庆２
张 东 杰１
ＳＨＥＮ Ｙａｎ１
ＷＡＮＧ Ｙｉｎｇ１，２
ＳＵＮ
Ｄａ－ｑｉｎｇ２
ＺＨＡＮＧ Ｄｏｎｇ－ｊｉｅ１
（１．黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 １６３３１９；２．国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江 大庆 １６３３１９）
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｂａｙｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｑｉｎｇ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ１６３３１９，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏａｒｓｅ Ｃｅｒｅａｌｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄａｑｉｎｇ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ１６３３１９，Ｃｈｉｎａ）
摘要：谷子作为一种在中国杂粮作物 中 占 据 重 要 地 位 的 粮 食 作物，其全基因组测序的完成极大地 促 进 了 谷 子 分 子 标 记 技 术的发展。ＳＳＲ 作 为 第 二 代 分 子 标 记，具 有 操 作 简 单、重 复 性好、结果可靠等优势，现已被广泛 应 用 于 作 物 遗 传 多 样 性 、 遗传连锁图谱 构 建、数 量 性 状 分 析、品 种 鉴 定 等 研 究。 文 章 对ＳＳＲ 标记技术在谷子遗传多样性、遗传连锁图谱等方面的 研究进行综述，以期为中国谷子ＳＳＲ 标记技术发展提供参考 与借鉴。 关 键 词 ：谷 子 ；ＳＳＲ；分 子 标 记 ；应 用 Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｆｏｘｔａｉｌ ｍｉｌｌｅｔ ｗａｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｉｎ ｇｒａｉｎ ｃｒｏｐｓ．Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｉｔ ｈａｄ ｇｒｅａｔｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｆｏｘｔａｉｌ ｍｉｌｌｅｔ．Ａｓ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ｗｉｔｈ ａ ｓｉｍｐｌｅ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ｇｏｏｄ ｒｅ－ ｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ，ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｗｉｄｅｌｙ ａｄｏｐｔｅｄ ｉｎ ｃｒｏｐ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｃｏｎ－ ｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐ，ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｓｈａｐｅ，ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｆｏｘｔａｉｌ ｍｉｌｌｅｔ ｗｅｒｅ ｒｅｖｉｅｗｅｄ， ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅ－ ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｆｏｘｔａｉｌ ｍｉｌｌｅｔ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｆｏｘｔａｉｌ ｍｉｌｌｅｔ；ＳＳＲ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ；ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
１．１ 基因组 ＳＳＲ 标记的开发 传统的基因组ＳＳＲ 开发，多需要建立富含某种碱基重复 单元的基因组文库，利 用 探 针 筛 选 阳 性 克 隆 并 测 序，序 列 分 析鉴定后，利用这 些 富 含 ＳＳＲ 的 序 列 设 计 引 物 并 用 于 ＰＣＲ 扩 增 。 ［２７］ 例 如 贾 小 平 等 通 ［２８］ 过 选 择 扩 增 微 卫 星 法 获 得 谷 子 ＳＳＲ 序列１６３个，成 功 设 计 ６０ 个 特 异 性 引 物，其 中 ５５ 个 属 于完 整 型 重 复 ，５个 属 于 复 合 型 重 复 。 马 丽 华 等 主 ［２９］ 要 通 过 ５’锚定 ＰＣＲ 技 术，利 用 豫 谷 １ 构 建 基 因 组 文 库 分 离 得 到 谷 子 微 卫 星 序 列 １４０ 个，含 有 ＧＴ／ＣＡ、ＴＧ／ＡＣ、ＧＡ／ＣＴ 和 ＡＧ／ＴＣ 四类重复基元，但大部分克隆 ＳＳＲ 序列较短。 随 着 谷 子 基 因 组 测 序 项 目 的 完 成 ，基 于 谷 子 基 因 组 ＤＮＡ 序列和生物 信 息 学 软 件 分 析，可 以 直 接 预 测 获 得 大 量 的ＳＳＲ 标记，从而根据研究目的设计不同的特异性引物进行 ＳＳＲ 标记的验证和应用。目前，基于 谷 子 基 因 组 序 列 开 发 的 ＳＳＲ 标记及其 应 用 已 有 少 量 报 道 ，如 张 晗 等 利 ［３０］ 用 Ｐｈｙｔｏ－ ｚｏｍｅ数据库，搜索得到２１ １５０．７８ｋｂ谷 子 基 因 组 序 列，其 中 含有１ ８７２个 ＳＳＲ，包含１２６种重复基 元，其 中 ６３．４１％ 为 二 核苷酸类型，３１．８６％为三核 苷 酸 类 型。基 于 搜 索 到 的 ＳＳＲ， 设计７４对特异性引物，其中 ６４ 对 引 物 可 以 稳 定 扩 增。利 用 ４０对引物对 ２７ 份 谷 子 品 种 进 行 多 态 性 检 验 ，２７ 对 引 物 扩 增 良好 且 多 态 性 丰 富，共 扩 增 出 ２２０ 个 等 位 变 异，平 均 每 个 位 点８．１５ 个。Ｇａｒｉｍａ Ｐａｎｄｅｙ等 对 ［２４］ 谷 子 的 全 基 因 组 进 行 开 发，发现２８ ３４２个微卫 星 片 段，共 设 计 ２１ ２９４ 对 引 物，其 中 １５ ５７３ 对 分 布 在 ９ 个 染 色 体 上 。 １．２ ＥＳＴ－ＳＳＲ 标记的开发 表 达 序 列 标 签 （ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ，ＥＳＴｓ）是 ｃＤＮＡ 文库中随机 挑 选 克 隆，对 其 进 行 大 规 模 测 序 所 获 得 的 部 分 ｃＤＮＡ 的５’端或３’端序列，长度一般为１５０～５００ｂｐ［３１］。 利 用 ＥＳＴ 能够有效、快速地获取大 规 模 基 因 组 序 列，这 极 大 地 促进了 基 因 差 异 表 达、寻 找 新 基 因、构 建 遗 传 图 谱、制 备 ＤＮＡ 芯片及 比 较 基 因 组 学 等 研 究 的 发 展［３２］。ＥＳＴ－ＳＳＲ 标 记的开发主要是通 过 对 含 有 ＳＳＲ 的 ＥＳＴ 进 行 筛 选，根 据 其 两侧保守的单 拷 贝 序 列 设 计 特 异 性 引 物，利 用 ＰＣＲ 扩 增 得 到基因组编码区 中 的 微 卫 星 序 列。ＥＳＴ－ＳＳＲ 与 基 因 组 ＳＳＲ 相比，技术和原理十分相似，主 要 区 别 在 于 ＥＳＴ－ＳＳＲ 存 在 于 基因组编码区内，因此可以更充分地 反 映 出 植 物 基 因 组 的 功 能 信 息［３３］。Ｋａｊａｌ Ｋｕｍａｒｉ等 利 ［３４］ 用 ＮＣＢＩ中 已 知 的 ６６ ０２７ 个谷子 ＥＳＴ 片段推断出２４ ８２８个非冗 余 ＥＳＴ 片 段，成 功 设 计 ４４７ 对 引 物 ，其 中 ３２７ 对 分 布 在 谷 子 ９ 个 染 色 体 上 。
１ 谷子 ＳＳＲ 标记开发
ＳＳＲ 按标记开发方式 可 分 为 基 因 组 ＳＳＲ 和 表 达 序 列 标
研究进展
源自文库
２０１６ 年 第 ３ 期
签 ＳＳＲ（ＥＳＴ－ＳＳＲ）［２５］。基 因组 ＳＳＲ 是 基 于 全 基 因 组 序 列 开 发的，由于探针设计的局 限，传 统 基 因 组 ＳＳＲ 开 发 方 法 费 时 费力，且开发 的 ＳＳＲ 种 类 有 限。 随 着 谷 子 基 因 组 测 序 的 完 成，为ＳＳＲ 标记技术研究提供大量的序列信息并促进了此技 术在谷子中的发 展；ＥＳＴ－ＳＳＲ 是 指 在 基 因 编 码 区 内 的 ＳＳＲ， 不 包 括 内 含 子 及 非 编 码 区 中 的 ＳＳＲ，通 常 ３ 个 碱 基 重 复 的 ＳＳＲ 居多。作为一种 引 物 特 异 性 标 记，ＳＳＲ 必 须 在 ＤＮＡ 序 列已知的情况 下 进 行 引 物 设 计 及 ＰＣＲ 扩 增，如 何 筛 选 到 效 果 显 著 且 种 属 特 异 的 ＳＳＲ 引 物 是 ＳＳＲ 技 术 应 用 的 关 键 问 题 。 ［２６］
士 生 导 师 。Ｅ－ｍａｉｌ：ｂｙｎｄｚｄｊ＠１２６．ｃｏｍ 收 稿 日 期 ：２０１５－０８－１７
２２２
以及钙、铜、铁、锌、硒、碘、镁 等 微 量 元 素，营 养 保 健 作 用 也 非 常显著，因此被广 泛 加 工 和 研 发 成 一 系 列 方 便 食 用 的 产 品。 谷子与水稻的基因组结构具有明显 的 共 线 性，为 二 倍 体 自 花 授粉作物，基因 组 较 小，约 ４９０ Ｍｂ，基 于 此，谷 子 易 被 选 为 基 因组研究的目标对象。 ＳＳＲ（ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔｓ）又 称 为 微 卫 星，是 一 类 在 真核生物和原核生物基因组编码区及非编码区中广泛存在、 分散度高、多态性良好的简单重 复 序 列［３］。ＳＳＲ 在 植 物 基 因 组中分布随机；两侧序列较保守；多数 ＳＳＲ 无功能性，位点变 异广泛存在于各品 种 间；一 般 以 少 数 几 个 （通 常 为 １～６ｂｐ） 核苷酸为 重 复 单 位 的 首 尾 串 联 重 复 ＤＮＡ 序 列，如 （ＴＧ）ｎ， （ＣＡ）ｎ，（ＧＧＣ）ｎ等，其中ｎ 代表重复次数，重复次数从几个到 几十个不等［４］。典型的 ＳＳＲ 一般由５～１００个串联重复序列 单 位 构 成［５］。ＳＳＲ 标 记 为 共 显 性 分 子 标 记［６］，扩 增 时 需 要 少 量模 板 ＤＮＡ，即 便 ＤＮＡ 降 解，也 能 有 效 地 分 析 鉴 定。 利 用 ＳＳＲ 两侧单拷 贝 序 列 可 设 计 出 一 对 特 异 性 引 物 ，通 过 ＰＣＲ （ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）即聚 合 酶 链 式 反 应 技 术，一 种 在 体外快速扩增特定 基 因 或 ＤＮＡ 序 列 的 方 法 进 行 扩 增［７］，得 到目的 ＳＳＲ 片段，多利用电泳技术分析获得长度多态性［８］。 ＳＳＲ 作为第二代分子标记，与 ＲＡＰＤ、ＲＦＬＰ 等分子标记 技术 相 比，具 有 操 作 简 单、重 复 性 好、结 果 可 靠 等 特 点，现 已 在 植 物 遗 传 研 究 和 育 种 中 广 泛 应 用 ，如 系 谱 分 析［９－１０］、群 体 遗 传 学 、遗 ［１１－１２］ 传 图 谱 构 建 等 ［１３］ 方 面 。 尽 管 ＳＳＲ 分 子 标 记 具有上述这些优 点，但 利 用 传 统 方 式 进 行 开 发 的 难 度 较 大， 对 于 人 力 物 力 的 损 耗 也 较 大 。 ［１４］ 迄 今 为 止 ，ＳＳＲ 技 术 已 在 水 稻［１５］、玉 米 、小 ［１６－１７］ 麦 、大 ［１８－１９］ 豆 、高 ［２０－２１］ 粱［２２］、绿 豆［２３］ 等农作物中得到比较深入地研究 与 应 用。 近 年，随 着 谷 子 全 基 因 组 测 序 的 完 成［２４］，谷 子 ＳＳＲ 标 记 的 开 发 与 应 用 研 究 逐 渐增多，有力地促进了谷子遗传、育 种、栽 培 等 方 面 的 研 究 与 应用。
ＤＯＩ：１０．１３６５２／ｊ．ｉｓｓｎ．１００３－５７８８．２０１６．０３．０４９
OOD & MACHINERY 食品与机械
Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．３ Ｍａｒ ．２ ０ １ ６
谷子 ＳＳＲ 分子标记的研究进展
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓ ｏｎ ＳＳＲ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｆｏｘｔａｉｌ ｍｉｌｌｅｔ
基金项目：“十 二 五 ”农 村 领 域 国 家 科 技 计 划 项 目 （编 号： ２０１２ＢＡＤ３４Ｂ０２）；黑龙江省应 用 技 术 与 开 发 重 大 项 目 （编 号 ：ＧＡ１４Ｂ１０４）
作 者 简 介 ：沈 琰 ，女 ，黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 在 读 硕 士 研 究 生 。 通讯作者：张东杰（１９６６－），男，黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 教 授，博 士，博
谷子亦称粟米，是 最 早 起 源 于 中 国 的 重 要 杂 粮，迄 今 已 有８ ７００年的栽培史［１］。谷 子 属 禾 木 科 狗 尾 草 属 作 物 ，具 有 生育期短、耐旱、耐瘠等生理特性，广 泛 分 布 于 亚 欧 大 陆 的 温 带和热带，是中国黄河中上游地 区 主 要 栽 培 作 物 之 一［２］。 同 时，谷 子 营 养 价 值 极 高，含 有 丰 富 的 氨 基 酸、蛋 白 质、维 生 素
沈 琰１ 王 颖１，２
孙 大 庆２
张 东 杰１
ＳＨＥＮ Ｙａｎ１
ＷＡＮＧ Ｙｉｎｇ１，２
ＳＵＮ
Ｄａ－ｑｉｎｇ２
ＺＨＡＮＧ Ｄｏｎｇ－ｊｉｅ１
（１．黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 １６３３１９；２．国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江 大庆 １６３３１９）
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｂａｙｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｑｉｎｇ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ１６３３１９，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏａｒｓｅ Ｃｅｒｅａｌｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄａｑｉｎｇ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ１６３３１９，Ｃｈｉｎａ）
摘要：谷子作为一种在中国杂粮作物 中 占 据 重 要 地 位 的 粮 食 作物，其全基因组测序的完成极大地 促 进 了 谷 子 分 子 标 记 技 术的发展。ＳＳＲ 作 为 第 二 代 分 子 标 记，具 有 操 作 简 单、重 复 性好、结果可靠等优势，现已被广泛 应 用 于 作 物 遗 传 多 样 性 、 遗传连锁图谱 构 建、数 量 性 状 分 析、品 种 鉴 定 等 研 究。 文 章 对ＳＳＲ 标记技术在谷子遗传多样性、遗传连锁图谱等方面的 研究进行综述，以期为中国谷子ＳＳＲ 标记技术发展提供参考 与借鉴。 关 键 词 ：谷 子 ；ＳＳＲ；分 子 标 记 ；应 用 Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｆｏｘｔａｉｌ ｍｉｌｌｅｔ ｗａｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｉｎ ｇｒａｉｎ ｃｒｏｐｓ．Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｉｔ ｈａｄ ｇｒｅａｔｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｆｏｘｔａｉｌ ｍｉｌｌｅｔ．Ａｓ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ｗｉｔｈ ａ ｓｉｍｐｌｅ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ｇｏｏｄ ｒｅ－ ｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ，ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｗｉｄｅｌｙ ａｄｏｐｔｅｄ ｉｎ ｃｒｏｐ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｃｏｎ－ ｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐ，ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｓｈａｐｅ，ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｆｏｘｔａｉｌ ｍｉｌｌｅｔ ｗｅｒｅ ｒｅｖｉｅｗｅｄ， ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅ－ ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｆｏｘｔａｉｌ ｍｉｌｌｅｔ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｆｏｘｔａｉｌ ｍｉｌｌｅｔ；ＳＳＲ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ；ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
１．１ 基因组 ＳＳＲ 标记的开发 传统的基因组ＳＳＲ 开发，多需要建立富含某种碱基重复 单元的基因组文库，利 用 探 针 筛 选 阳 性 克 隆 并 测 序，序 列 分 析鉴定后，利用这 些 富 含 ＳＳＲ 的 序 列 设 计 引 物 并 用 于 ＰＣＲ 扩 增 。 ［２７］ 例 如 贾 小 平 等 通 ［２８］ 过 选 择 扩 增 微 卫 星 法 获 得 谷 子 ＳＳＲ 序列１６３个，成 功 设 计 ６０ 个 特 异 性 引 物，其 中 ５５ 个 属 于完 整 型 重 复 ，５个 属 于 复 合 型 重 复 。 马 丽 华 等 主 ［２９］ 要 通 过 ５’锚定 ＰＣＲ 技 术，利 用 豫 谷 １ 构 建 基 因 组 文 库 分 离 得 到 谷 子 微 卫 星 序 列 １４０ 个，含 有 ＧＴ／ＣＡ、ＴＧ／ＡＣ、ＧＡ／ＣＴ 和 ＡＧ／ＴＣ 四类重复基元，但大部分克隆 ＳＳＲ 序列较短。 随 着 谷 子 基 因 组 测 序 项 目 的 完 成 ，基 于 谷 子 基 因 组 ＤＮＡ 序列和生物 信 息 学 软 件 分 析，可 以 直 接 预 测 获 得 大 量 的ＳＳＲ 标记，从而根据研究目的设计不同的特异性引物进行 ＳＳＲ 标记的验证和应用。目前，基于 谷 子 基 因 组 序 列 开 发 的 ＳＳＲ 标记及其 应 用 已 有 少 量 报 道 ，如 张 晗 等 利 ［３０］ 用 Ｐｈｙｔｏ－ ｚｏｍｅ数据库，搜索得到２１ １５０．７８ｋｂ谷 子 基 因 组 序 列，其 中 含有１ ８７２个 ＳＳＲ，包含１２６种重复基 元，其 中 ６３．４１％ 为 二 核苷酸类型，３１．８６％为三核 苷 酸 类 型。基 于 搜 索 到 的 ＳＳＲ， 设计７４对特异性引物，其中 ６４ 对 引 物 可 以 稳 定 扩 增。利 用 ４０对引物对 ２７ 份 谷 子 品 种 进 行 多 态 性 检 验 ，２７ 对 引 物 扩 增 良好 且 多 态 性 丰 富，共 扩 增 出 ２２０ 个 等 位 变 异，平 均 每 个 位 点８．１５ 个。Ｇａｒｉｍａ Ｐａｎｄｅｙ等 对 ［２４］ 谷 子 的 全 基 因 组 进 行 开 发，发现２８ ３４２个微卫 星 片 段，共 设 计 ２１ ２９４ 对 引 物，其 中 １５ ５７３ 对 分 布 在 ９ 个 染 色 体 上 。 １．２ ＥＳＴ－ＳＳＲ 标记的开发 表 达 序 列 标 签 （ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ，ＥＳＴｓ）是 ｃＤＮＡ 文库中随机 挑 选 克 隆，对 其 进 行 大 规 模 测 序 所 获 得 的 部 分 ｃＤＮＡ 的５’端或３’端序列，长度一般为１５０～５００ｂｐ［３１］。 利 用 ＥＳＴ 能够有效、快速地获取大 规 模 基 因 组 序 列，这 极 大 地 促进了 基 因 差 异 表 达、寻 找 新 基 因、构 建 遗 传 图 谱、制 备 ＤＮＡ 芯片及 比 较 基 因 组 学 等 研 究 的 发 展［３２］。ＥＳＴ－ＳＳＲ 标 记的开发主要是通 过 对 含 有 ＳＳＲ 的 ＥＳＴ 进 行 筛 选，根 据 其 两侧保守的单 拷 贝 序 列 设 计 特 异 性 引 物，利 用 ＰＣＲ 扩 增 得 到基因组编码区 中 的 微 卫 星 序 列。ＥＳＴ－ＳＳＲ 与 基 因 组 ＳＳＲ 相比，技术和原理十分相似，主 要 区 别 在 于 ＥＳＴ－ＳＳＲ 存 在 于 基因组编码区内，因此可以更充分地 反 映 出 植 物 基 因 组 的 功 能 信 息［３３］。Ｋａｊａｌ Ｋｕｍａｒｉ等 利 ［３４］ 用 ＮＣＢＩ中 已 知 的 ６６ ０２７ 个谷子 ＥＳＴ 片段推断出２４ ８２８个非冗 余 ＥＳＴ 片 段，成 功 设 计 ４４７ 对 引 物 ，其 中 ３２７ 对 分 布 在 谷 子 ９ 个 染 色 体 上 。
１ 谷子 ＳＳＲ 标记开发
ＳＳＲ 按标记开发方式 可 分 为 基 因 组 ＳＳＲ 和 表 达 序 列 标
研究进展
源自文库
２０１６ 年 第 ３ 期
签 ＳＳＲ（ＥＳＴ－ＳＳＲ）［２５］。基 因组 ＳＳＲ 是 基 于 全 基 因 组 序 列 开 发的，由于探针设计的局 限，传 统 基 因 组 ＳＳＲ 开 发 方 法 费 时 费力，且开发 的 ＳＳＲ 种 类 有 限。 随 着 谷 子 基 因 组 测 序 的 完 成，为ＳＳＲ 标记技术研究提供大量的序列信息并促进了此技 术在谷子中的发 展；ＥＳＴ－ＳＳＲ 是 指 在 基 因 编 码 区 内 的 ＳＳＲ， 不 包 括 内 含 子 及 非 编 码 区 中 的 ＳＳＲ，通 常 ３ 个 碱 基 重 复 的 ＳＳＲ 居多。作为一种 引 物 特 异 性 标 记，ＳＳＲ 必 须 在 ＤＮＡ 序 列已知的情况 下 进 行 引 物 设 计 及 ＰＣＲ 扩 增，如 何 筛 选 到 效 果 显 著 且 种 属 特 异 的 ＳＳＲ 引 物 是 ＳＳＲ 技 术 应 用 的 关 键 问 题 。 ［２６］
士 生 导 师 。Ｅ－ｍａｉｌ：ｂｙｎｄｚｄｊ＠１２６．ｃｏｍ 收 稿 日 期 ：２０１５－０８－１７
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以及钙、铜、铁、锌、硒、碘、镁 等 微 量 元 素，营 养 保 健 作 用 也 非 常显著，因此被广 泛 加 工 和 研 发 成 一 系 列 方 便 食 用 的 产 品。 谷子与水稻的基因组结构具有明显 的 共 线 性，为 二 倍 体 自 花 授粉作物，基因 组 较 小，约 ４９０ Ｍｂ，基 于 此，谷 子 易 被 选 为 基 因组研究的目标对象。 ＳＳＲ（ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔｓ）又 称 为 微 卫 星，是 一 类 在 真核生物和原核生物基因组编码区及非编码区中广泛存在、 分散度高、多态性良好的简单重 复 序 列［３］。ＳＳＲ 在 植 物 基 因 组中分布随机；两侧序列较保守；多数 ＳＳＲ 无功能性，位点变 异广泛存在于各品 种 间；一 般 以 少 数 几 个 （通 常 为 １～６ｂｐ） 核苷酸为 重 复 单 位 的 首 尾 串 联 重 复 ＤＮＡ 序 列，如 （ＴＧ）ｎ， （ＣＡ）ｎ，（ＧＧＣ）ｎ等，其中ｎ 代表重复次数，重复次数从几个到 几十个不等［４］。典型的 ＳＳＲ 一般由５～１００个串联重复序列 单 位 构 成［５］。ＳＳＲ 标 记 为 共 显 性 分 子 标 记［６］，扩 增 时 需 要 少 量模 板 ＤＮＡ，即 便 ＤＮＡ 降 解，也 能 有 效 地 分 析 鉴 定。 利 用 ＳＳＲ 两侧单拷 贝 序 列 可 设 计 出 一 对 特 异 性 引 物 ，通 过 ＰＣＲ （ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）即聚 合 酶 链 式 反 应 技 术，一 种 在 体外快速扩增特定 基 因 或 ＤＮＡ 序 列 的 方 法 进 行 扩 增［７］，得 到目的 ＳＳＲ 片段，多利用电泳技术分析获得长度多态性［８］。 ＳＳＲ 作为第二代分子标记，与 ＲＡＰＤ、ＲＦＬＰ 等分子标记 技术 相 比，具 有 操 作 简 单、重 复 性 好、结 果 可 靠 等 特 点，现 已 在 植 物 遗 传 研 究 和 育 种 中 广 泛 应 用 ，如 系 谱 分 析［９－１０］、群 体 遗 传 学 、遗 ［１１－１２］ 传 图 谱 构 建 等 ［１３］ 方 面 。 尽 管 ＳＳＲ 分 子 标 记 具有上述这些优 点，但 利 用 传 统 方 式 进 行 开 发 的 难 度 较 大， 对 于 人 力 物 力 的 损 耗 也 较 大 。 ［１４］ 迄 今 为 止 ，ＳＳＲ 技 术 已 在 水 稻［１５］、玉 米 、小 ［１６－１７］ 麦 、大 ［１８－１９］ 豆 、高 ［２０－２１］ 粱［２２］、绿 豆［２３］ 等农作物中得到比较深入地研究 与 应 用。 近 年，随 着 谷 子 全 基 因 组 测 序 的 完 成［２４］，谷 子 ＳＳＲ 标 记 的 开 发 与 应 用 研 究 逐 渐增多，有力地促进了谷子遗传、育 种、栽 培 等 方 面 的 研 究 与 应用。