有机废物好氧堆肥实验

有机废物好氧堆肥实验【实验目的】1.通过参与好氧堆肥实验装置的建立和全过程参数检测，了解作为有机废物无害化。

资源化处理处置方法之一的堆肥技术的典型过程及技术特征。

2.通过已掌握的微生物群落检测、计数方法，了解堆肥不同过程的微生物学变化特征。

3.掌握堆肥腐熟度检测方法之一的种子发芽率和发芽指数法。

【实验原理】堆肥化（composting）是指依靠自然界广泛分布的细菌、放线菌、真菌等微生物，或是通过人工接种待定功能的菌，在一定工况条件下，有控制地促进可被生物降解的有机物向稳定的腐殖质转化的生物化学过程，其实质是一种生物代谢过程。

废物经过堆肥化处理，制得的成品称堆肥（compost）。

好氧堆肥中底物的降解是细菌、放线菌和真菌等多种微生物共同作用的结果，在一个完整的好氧高温堆肥的各个阶段，微生物的群落结构演替非常迅速，即在堆肥这个动态过程中，占优势的微生物区系随着不同堆肥阶段的温度，含水率，好氧速率，pH值等理化性质的改变进行着相应的演替。

本实验通过学生全过程参与好氧堆肥装置的建立和关键参数检测，了解作为有机废物无害化、资源化处理处置方法之一的堆肥技术的典型过程及技术特征，掌握堆肥关键参数的检测方法，主要包括以下三部分内容：1.堆肥过程特征参数检测分析：包括堆温、pH、气体成分和含量变化监测2.堆肥过程微生物群落变化分析：采用平板计数法检测微生物种群的数量来研究高温阶段和堆肥腐熟阶段微生物种群结构和数量的变化，包括细菌、放线菌、真菌以及纤维素分解菌。

3.堆肥腐熟度检测：堆肥腐熟度是指堆肥产品的稳定程度。

判断堆肥腐熟度的指标包括物理学指标、化学指标（包括腐殖质）和生物学指标。

其中简单的判断堆肥腐熟的方法包括：1)根据外观和气味：在堆肥化过程中，物料的色度和气味的变化反映出微生物的活跃程度。

对于正常的堆肥过程，随着进程的不断推进，堆肥物料的颜色逐渐发黑，腐熟后的堆肥产品呈黑褐色或黑色，气味由最初的氨味转变成土腥味。

Sugahara等提出一种简单的技术用于检测堆肥产品的色度，并回归出一关系式：⁄)+8.13（R2=0.749）Y=(0.388C N其中Y是响应值（颜色分析值）；他们认为Y值为11~13的堆肥产品是腐熟的。

使用该法时要注意取样的代表性。

不过，堆肥的色度显然受其原料成分的影响，很难建立统一的色度标准以判断各种堆肥的腐熟程度。

2)根据发酵温度：前期发酵的终点温度（40~50℃）与有机质分解速率一样是微生物活动的尺度。

温度的变化与堆肥过程中的微生物代谢活性有关，研究表明二者之间的关系可用如下关系式表示：K T=K20θ(T−20)（K T、K20分别为温度在T、20℃时的呼吸速率，θ：常数）。

当微生物活动减弱时，热量的上升率也相应下降，导致堆肥的温度下降。

但不同堆肥系统的温度变化差别显著。

由于堆体为非均相体系，其各个区域的温度分布不均衡，限制了温度作为腐熟度定量指标的应用。

国际上一些学者提出，某一堆肥系统在经过一次高温后，如果在最佳的工况条件下也不能再次升温，则可判断该系统基本达到腐熟。

3)种子发芽指数（GI）：未腐熟的堆肥含有植物毒性物质，对植物的生长产生抑制作用，因此，考虑到堆肥腐熟度的实用意义，植物生长实验应是评价堆肥腐熟度的最终和最具说服力的方法。

一般来讲，当堆肥水浸提液cress 种子发芽指数（GI）达到或超过50%时，可以认为堆肥已基本腐熟，对于种子的发芽基本无毒性。

本实验中用黑麦草种子发芽指数对秸秆和厨余废物好氧公堆肥产物的植物毒性进行评判和比较。

【实验设备与材料】1.恒温生化培养箱2.干燥箱3.恒温摇床4.pH计5.灭菌锅6.菌落计数仪7.电子天平8.培养皿，试管，玻璃三角瓶，移液管，玻璃刮刀，白磁板等若干9.（温度、氧气）在线监测式好氧堆肥反应器所用培养基主要有：1.营养琼脂（用于总细菌的计数）2.UBA琼脂（用于放线菌的计数）3.孟加拉红琼脂（用于真菌的计数）4.滤纸条纤维素培养基（用于纤维素分解菌的计数）【实验内容】1.堆肥过程特征参数的监测与分析1)100L堆肥反应器的准备（由实验室进行），样本1为处于高温阶段的堆肥，样本2为处于稳定期（腐熟度）的堆肥。

堆料为6：4：1（重量比）的花卉秸秆、蔬菜废物和土壤。

2)堆温检测：用温度探头检测堆体中部的温度，并从数字控制显示器读取数据，监测时间为每隔6小时一次（每天15、21、3、9时），持续过程为16次（4天）。

3)堆料pH变化：从堆体中取出10g样，用蒸馏水配成固液比5%的悬浮液，摇床振荡10min后左右，用pH计检测。

4)堆体出气口O2和CO2变化：将气体监测仪的探头深入反应器的出气口15cm处，从仪器的显示器读取稳定后的数据，监测时间为每隔6小时一次（每天15、21、3、9时），持续过程为16次（4天）。

2.平板稀释法检测不同堆肥微生物区系1)以无菌操作称取25g堆肥样品，放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌锥形瓶内，于200r/min恒温摇床中振荡15~20min，制成1：10样品匀液（悬浊液）。

2)将样品进一步做倍比稀释，即用灭菌吸管吸取5mL样品，放入装有45mL 灭菌生理盐水的灭菌锥形瓶内，经充分振摇制成1：10样品匀液。

同时进行逐级稀释，直至获得适宜的稀释度。

3)取不同稀释度的稀释液0.1mL均匀滴于不同的选择性培养基上，用玻璃刮刀使其均匀涂布于培养基表面，分别计数细菌（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基）、放线菌（高氏一号培养基）和真菌（査氏培养基）的数目。

4)将涂布接种后的平板倒置在适温培养箱中培养3~5天，选取菌落分布均匀且平均菌落数在30~300之间者进行计数。

5)另称取25g样品，置于105℃下烘干至恒重，算出样品的含水率，用干重表示底物中的含菌量：每克干物质的含菌数=每克新鲜物质中的菌数×含水率3.3试管MPN法检测纤维素分解菌的种群密度1)将样品按上述方法进行逐级稀释后，取不同稀释度的稀释液1mL，无菌操作接种于装有已灭菌的9 mL依姆涅茨基纤维素分解菌培养基中。

每个稀释度的重复接种3管。

2)30℃恒温培养14d，检查各试管中滤纸条上出现的菌落、滤纸的断裂情况和滤纸上产生的色素和黏液，记录观察结果。

有明显的微生物生长和滤纸条断裂的试管记为+结果3)MPN的计算MPN法又称最可能数法或最近似值法，是用统计学方法来计算样品中某种待测菌含量的一种方法。

此方法适用于那些利用平板培养法不能进行活菌计数，却很容易在液体培养基中生长并被检测出来的微生物。

其计算原理遵循常规查表法中的Ziegler方程。

本实验采用MPN法检测堆肥不同阶段纤维素分解菌的种群密度。

4.堆肥腐熟度检测种子发芽率试验的具体操作步骤如下：1)堆肥水浸提液按鲜样：蒸馏水为1：10的体积比例振荡30min，离心（5000r/min）过滤后上清液贮藏于塑料瓶中备用；2)在培养皿中放入相同直径的滤纸一张，灭菌后均匀洒入15颗浸泡后的黑麦草种子，注入10mL的沤肥产物稀释物，取注入无菌去离子水的实验作为对照，在28℃下培养1周，统计根长和发芽率，发芽指数GI用下式计算：GI（%）=处理的种子发芽率×种子根长对照的种子发芽率×种子根长×100【实验结果及分析】说明：由于时间等原因，本组实验与实验指导内容有出入，实验指导中实验时间应为一个堆肥过程，而本组只进行了4天，同时指导中的堆温检测与出气口O2和CO2检测均为每天三次，而本组为每隔6小时一次。

这导致本组堆肥仅达到高温阶段，未达到熟化阶段。

1.堆肥过程特征参数的监测与分析1)好氧堆肥过程温度监测及变化特征分析在发酵罐中均匀布置6个测温点，从2011/11/15 15:00:00到2011/11/19 09:00:00每隔6小时测一组数据，绘制曲线如图1。

图1：好氧堆肥温度变化曲线在整个堆肥过程中温度先上升后下降，参考资料以及所学知识，堆肥过程依据时间先后依次出现四个阶段：a)潜伏阶段：指堆肥化开始时微生物适应新环境的过程，即驯化过程。

（1、2测次）b)中温增长阶段：这一阶段嗜温性微生物最为活跃，主要利用物料中的溶解性有机物大量繁殖，并释放出热量，使温度不断升高。

（3-6测次）c)高温阶段：当温度上升到45℃时称为高温阶段。

（7-13测次）这时，嗜热性微生物大量繁殖，嗜温性微生物受到抑制或死亡。

d)熟化阶段：在这一阶段，温度逐渐下降至中温，并最终过渡到环境温度。

（14-16测次，及其后时间）本组堆肥的潜伏及中温增长阶段较短，在实验第三天即进入高温阶段，并在第四天达到最高温度51.54℃。

随后为熟化阶段，根据推测，温度会逐渐降至环境温度。

2)好氧堆肥过程pH监测及变化特征分析图2：好氧堆肥pH变化曲线在实验过程中pH主要趋势为下降，中间有上升波动，由于本组未完成堆肥，根据其他组的结果，依据时间先后依次出现三个阶段：a)pH下降阶段：在堆肥初期，堆肥物产生有机酸，这有利于微生物的生存和繁殖，pH可以下降到4.5—5.0。

b)pH上升阶段：随着有机物的逐渐被分解，pH值逐渐上升，最终可以达到8—8.5左右。

c)pH稳定阶段：有机物基本分解完毕，pH稳定在8—8.5左右。

由于本组实验并未完成，根据数据可以知道，在实验期间，堆肥一直处于pH 下降阶段。

3)好氧堆肥过程出气口O2和CO2监测变化特征分析图3：好氧堆肥氧气含量变化曲线从数据来看，堆肥过程中，出气口氧气含量总体来说是比较稳定，中间有小幅度波动。

在堆肥过程中，随着实验的进行，温度先升高再下降，有机物含量也在逐渐因消耗而减少，微生物分解有机物的活跃程度也随之逐渐减少趋于稳定。

当堆肥初期，温度逐渐上升，有机物充足，微生物分解活动活跃，反应进行的较快，耗氧速率较高，表现在中温增长阶段和高温期的前期，反之在高温期以及随后的熟化阶段，耗氧速率逐渐下降直至稳定。

因此，堆体的好氧速率应该是先升高再下降，而出气口的氧气含量应先下降，再逐渐升高恢复至接近入口浓度并维持稳定。

与氧气含量相对应，堆肥过程中，二氧化碳的含量应该恰好与氧气相反，在实验前期微生物对有机物进行分解，释放二氧化碳，随着反应的进行，又逐渐减少而趋于稳定。

出气口的二氧化碳浓度应该先增大后逐渐减小。

图4：好氧堆肥二氧化碳含量变化曲线4)上述特征参数变化与堆体微生物反应的关系分析a)堆肥反应前期，微生物代谢活跃，利用有机物分解释放的能量合成自身成分，释放热量。

导致温度上升，耗氧量升高，二氧化碳产生量下降，同时产生的有机酸使堆体pH下降。

b)堆肥反应后期，微生物代谢变缓，分解合成作用减慢，放热减少。

导致温度下降，耗氧量下降，二氧化碳产生量上升，有机酸分解使堆体pH上升。

c)熟化阶段，剩余有机质大部分为难降解物质，腐殖质大量合成并趋于稳定化。