有机介质中酶催化的基本原理

Abstract Nonagueous enzymoIogy has attracted more and more interests from researchers and industry because of the unigue properties provided by enzymes in nonagueous environments . Supported by an exponentiaI growth of the Iiterature，this rapidIy deveIoping research area has made tremendous progress in recent years in gaining an improved fundamentaI understanding of enzyme function and activation in organic media . In such a non-conventionaI miIieu，the enzyme maintains its structuraI and mechanistic integrity . The roIe of water and soIvents on enzyme function has been discussed in detaiI，such as the effects of water on enzyme activity and protein mobiIity，the effects of soIvent on the water associated with the enzyme，on enzyme’s active site and protein dynamics and conformation，on substrates and products，and on the enzymatic activation energy . A series of methods and technigues for activating enzymes in organic soIvents have been summarized，such as to overcome the Iimitations in diffusion and accessibiIity，to optimize the pH situation，to minimize the effect of soIvents on activation energy，to enhance the conformationaI mobiIity of the enzyme， and to prevent enzyme denaturation during dehydration by IyophiIizing enzymes in the presence of a seIection of organic or inorganic excipients（e . g . nonbuffer saIts or macrocycIes）. These technigues are guite simpIe and scaIabIe，and can promote a wide range of enzyme activation（up to 105 -foId）through different mechanisms . AII these wiII undoubtedIy heIp us to effectiveIy design high-activity enzyme preparations suitabIe for use in organic soIvents and to broaden the appIications of nonagueous enzymoIogy to a greater extent .
对有机环境里脂肪酶和丝氨酸蛋白酶是否同样 遵循“酰基-酶”催化机理的直接证明来自对丝氨酸 蛋白酶（Carlsberg 枯草溶菌蛋白酶）的“酰基-酶”中 间体 X 射线晶体结构的测定［13］。该中间体无论是 整体结构还是活性中心的区域结构，在水和无水乙 腈中均显示相同结构。因此基本上可以肯定，酶在 有机介质中的催化反应机理与在水里的相同。
二、酶在有机溶剂中的结构
首先要考虑的是酶在有机溶剂里能否保持其蛋 白质的天然折叠结构。这个问题实际上已经通过 X 射线结晶学、核磁共振、电子顺磁共振和傅立叶变换 红外光谱等技术得到了直接的证实。Klibanov 研究 组［5，6］运用 X 射线结晶学对 Carlsberg 枯草溶菌蛋白 酶晶体进行的结构分析表明，该酶的三维晶体结构 无论是在水里还是在两种有机溶剂（乙腈和二氧杂 环己烷）中都基本相同。对另外 3 种酶（在己烷里的 !-胰凝乳蛋白 酶［7］，在 乙 腈 里 的 弹 性 蛋 白 酶［8］和 鸡 蛋白溶菌酶［9］）的晶体结构研究也得出相同的结论。 对于在有机溶剂里经常用到的酶的冷冻干燥粉末， 其结构分析则可以通过傅立叶变换红外光谱等其它 技术手段获得。把枯草溶菌蛋白酶冷冻干燥后置于 具有完全不同性质的 10 种溶剂中，其蛋白质的二级 结构不随溶剂的改变而改变［10］。
三、酶在有机溶剂中的催化机理
酶的催化机理在有机介质中是否会改变，这是 另一个必须要考虑的重要问题。这个问题最好通过 对脂肪酶和丝氨酸蛋白酶的机理研究来回答。在水 溶液里，这两种酶通过“酰基-酶”的机理来催化酯的 水解反应［11］。在多种有机溶剂里，它们还能催化酯 和醇之间的转酯化反应。大量的酶动力学研究已经 间接证明了这些反应同样遵循“酰基-酶”的催化反 应机理（详细讨论请参见文献［4］）。Kim 等［12］也用 线性自由能关系证实了枯草溶菌蛋白酶催化转酯化 反应的催化机理没有因为溶剂极性的变化而改变。
视。在有机溶剂中，酶能催化ຫໍສະໝຸດ Baidu水里不能进行的化 学反应，其稳定性显著提高，与在水里相比，酶的活 性和各种专一性不仅会发生变化，而且还能通过改 变反应介质（而不是通过改造酶本身）来进行调节和 控制。同时，由于疏水性反应物溶解度的增加，产物 和酶的分离提纯便利，由水引起的副反应受到抑制，
收稿：2004 年 7 月，收修改稿：2004 年 11 月 !通讯联系人 e-maiI：zyang@ szu. edu. cn
关键词 非水酶学 酶活性 有机介质 催化机理 中图分类号：@55；T@426.97 文献标识码：A 文章编号：1005-281X（2005）05-0924-07
Fundamentals of Biocatalysis in Organic Solvents
Yang Zhen! （CoIIege of Life Science，Shenzhen University，Shenzhen 518060，China）
有两种方法可以使在有机介质里进行的反应体 系获得 恒 定 的 水 活 度：预 平 衡 法 和 无 机 盐 水 合 物 法［25］。其中第二种方法更简便，并能在反应过程中
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化学进展
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维持水活度不变。值得注意的是，直接加入反应体 系的无机盐水合物有可能对酶产生酸碱效应，从而 影响到酶的反应活性［26］。
微量的水对酶在有机介质中的活性影响很大。 酶在完全干燥的溶剂体系里基本上是不显催化能力 的，但是其活力会随着体系里水含量的增加而明显 加速。这是因为水的加入使酶活性中心的极性和结 构柔性大大提高［14，15］。在无水的状态下，酶分子的 带电基团和部分极性基团相互作用使酶分子形成一 种非活性的刚性结构。水的作用就是充当润滑剂， 与这些功能团形成氢键［16］，以降低蛋白质多肽链折 叠结构里带电基团之间的静电作用和极性基团之间 的偶极-偶极相互作用，从而提高蛋白质结构的柔韧 性和极化性［17］。Partridge 等［18］证实，增加酶的水合 作用比选用不同溶剂对酶的活性和结构柔韧性的改 变影响更大。另一方面，过多的水分又会使酶活性 下降，因为 酶 的 多 种 失 活 过 程 离 不 开 水 的 参 与［19］， 而且水分过多会促使酶分子聚集成团以影响底物和 产物的扩散，或者使酶活性中心内部生成水簇，从而 改变酶 的 结 构 并 最 终 导 致 酶 活 性 的 下 降［14，20］。 因 此，掌握最佳水量可以使酶在溶剂体系中达到最佳 的活性表达。
四、水的作用
如上所述，酶在有机溶剂里的蛋白质结构和催 化机理与在水里相同，这说明酶的内在催化性质并 没有因为水作为反应介质被有机溶剂所取代而受到 破坏。然而，酶在各种有机溶剂体系中表现出来的 催化性质（包括酶的活性、稳定性及专一性）却是相 差甚远，取决于反应体系中水的含量和所选用的溶 剂。因此，有必要就水和溶剂对酶催化所起的作用 进行深入的研究。
加入反应体系里的水分是在酶和溶剂之间分配 的，酶活性取决于吸附在酶分子上的水分而与溶剂 里的水含量无关［16］。Halling［21］认为 前 者 可 以 用 热 力学水活度（ !w）进行定量表征。目前，这一概念已 经被广泛 接 受［22］。 其 中 比 较 明 显 的 例 子 就 是 一 种 脂肪酶在 极 性 相 差 甚 远 的 几 种 溶 剂（ 如 己 烷、2-戊 酮）中显示最佳活性时所需的水活度均为 0 . 55［23］。 如果不控制水活度，酶的最佳水量是随着溶剂极性 的增加而增加的。这充分说明了控制水活度的重要 性。但是必须注意到，对一些极性溶剂如丙酮和四 氢呋喃，水活度并不能很好地定量表达酶分子上的 水含量［24］。这说明这些溶剂对酶有直接的作用。
第5期
杨 缜 有机介质中酶催化的基本原理
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以及微生物对反应器污染的减少，使酶作为催化剂 在工业应用上的价值大大提高。要充分利用这些优 越性，就必须对非水酶学的基本理论进行深入研究， 如酶的蛋白质结构，酶的催化机理，溶剂和水与酶的 相互作用及其对酶催化的动力学和热力学方面的影 响，以及酶结构与功能之间的相互关系。近年来，非 水酶学的 基 本 理 论 研 究 已 经 取 得 了 重 大 突 破［1—4］。 本文就这方面的进展作一综述。
Key words nonagueous enzymoIogy；enzyme activity；organic media；cataIytic mechanism
一、引 言
酶不仅在水溶液里而且在有机溶剂中具有催化 活性，这已经成为一个公认的事实。在有机介质中 进行酶催化已经成为生物技术领域的一个主要研究 方向，受到国内外学术界和工业界的广泛关注和重
虽然水对有机溶剂中的酶催化至关重要，所需 的水量却是因酶而异的。比如，酪氨酸酶在 aw = 1， 即酶分子周围有单水层环绕时显示最高活性［27］；而 Rhizomucor miehei 脂肪酶却在 aw < 0. 0001，即酶分子 周围仅附着几个水分子时已具有相当高的活性［28］。 其 它 脂 肪 酶 的 最 佳 aw 值 则 从 0. 12—1. 0 变 化 不等［29］。
就水解酶来说，水还能控制酶的反应方向。比 如脂肪酶在苯中催化丁酸乙烯酯和 1-辛醇之间的酯 基转移反应，同时伴随有水解副反应发生。酶对正 副反应的活性之比在低水活度状态（ aw < 0. 1）下高 达 9. 9 ，而在 aw = 0. 84 时仅是 0. 4，说明低水状态 有利于合成反应的进行［30］。
第 17 卷 第 5 期 2005 年 9 月
化学进展
PROGRESS IN CHEMISTRY
VoI . 17 No . 5 Sep . ，2005
有机介质中酶催化的基本原理
杨 缜!
（深圳大学生命科学学院 深圳 518060）
摘 要 酶在有机溶剂中催化作用的研究日益受到重视，其应用范围也越来越广。本文就有机介质中 酶催化的基本原理进行了讨论，包括酶的结构和催化机理，以及溶剂和水对酶的结构和催化功能的影响。同 时，本文归纳出提高酶活性的一系列方法，其中不少方法简便易行，能使酶活性提高 102 —105 倍。