动物细胞工程制药.pptx
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动物细胞工程制药
张忠山 生命科学学院
• 一、概述 • 二、动物细胞的形态和生理特点 • 三、生产用动物细胞的要求和获得 • 四、动物细胞的培养条件和培养基 • 五、动物细胞培养的方法和操作方式 • 六、动物细胞生物反应器及其检测控制系统 • 七、动物细胞制药的前景和展望
第一节 概述
• （1）发现细胞和细胞学说创立。1665年英 国物理学家Hooke通过自制的显微镜观察切 成薄片的软木时看到死细胞的细胞壁。
• 3、正常二倍体细胞的生长寿命是有限的
• 当细胞培养开始，称之为原代培养，经过传代后， 即成为有限细胞系，即有限的生长传代时间，取决 于细胞来源的种族和年龄，人胚成纤维细胞约可培 养50代，鸡胚的30代，小鼠的8代。但是若向培养 基中加入表皮生长因子，可使上皮细胞的寿命从原 来的50代增加至150代。
• 6、动物细胞蛋白合成途径和修饰功能与细菌不 同
• 场所：游离的核糖体以及粗面内质网上的核糖体， 前者合成的蛋白质都用于细胞质基质内，后者上 合成的蛋白质是分泌性的和膜中的整合蛋白，多 数为糖蛋白。
• 蛋白质上的糖链有的在内质网上加接，有的在高 尔基体中加接。其中内质网中加接的是N-链寡糖， 在高尔基体内加接的是O-链寡糖。
• 当细胞突变为异倍体后，该细胞可转变成无限细胞 系，或称连续细胞系。
动物细胞培养一代生长过程
4、动物细胞对周围环境比较敏感 无细胞壁保护，因而外界的物理化学因素很容易
产生影响。
5、动物细胞培养基的要求高 与细菌和植物细胞不同，其需要12种必需氨基酸、
8种以上的维生素、多种无机盐和微量元素、作为 主要碳原的葡萄糖以及多种细胞生长因子和贴附因 子，而且不同种类要求又有变化。
二、动物细胞的生理特点
• 1、细胞的分裂周期长 一般为12~48h，细胞分裂周期=间期（G1期+S 期+G2期）+分裂期（M期）
G1期：凡细胞无增殖活动时皆滞留在G1期 S 期：DNA的合成，一般为6~8小时
• G2期：DNA量加倍，RNA合成和染色体螺旋 化，持续时间短，一般为2~5h。
• M期：一般持续时间很短，仅0.5~1h。相当于 有丝分裂的中后期和末期，主要是染色体的 变化、分裂，并形成子细胞。
• 细胞分裂代数与培养中的代数及相互关系。
• 2、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现 象
• 大多数正常二倍体（dipoid）细胞的生长都需 要一定的基质（如玻璃，塑料等）上贴附， 伸展后才能生长增殖，其机制可能与电荷、 钙镁离子的作用以及许多贴附因子有关。
• 当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时， 细胞与其周围细胞相互接触时，细胞才停止 增殖。保持一定的营养，细胞仍可存活一段 时间，但细胞密度不再增加，该现象就称为 接触抑制或密度依赖抑制现象。一旦细胞转 化为异倍体后，该现象消失，细胞可多层生 长，细胞密度可大大增、产量低。 • 优点：分泌胞外、纯化方便、翻译后修饰糖
基化，与天然产品一致。
第三节 生产用动物细胞的要求 和获得
• 一、生产用动物细胞的要求 • 二、生产动物细胞的获得 • 三、常用生产用动物细胞的特性 • 四、基因工程细胞的构建和筛选 • 五、细胞库的筛选
传代细胞的要求
• 正常原代细胞 二倍体细胞 无限制 • 癌细胞生产药物需谨慎！
一、生产用动物细胞的要求
• （1）原代正常组织分离的细胞 • （2）二倍体细胞，即使是传代细胞 • （3）传代细胞用于生产 • （4）按照FDA对细胞株的要求，控制最终
产品中DNA残留量。
• 1、原代细胞：是直接取自动物组织、器官， 经过粉碎、消化而获得的细胞悬液。一般1g 组织约有109个细胞。
• （4）细胞工程制药成为现代制药技术中常用的手段。
应用领域
• 生产药品：作为宿主细胞表达生产原核细胞 所不能生产的药用蛋白。
• 基础研究的细胞材料：细胞模型 • 种子细胞：为组织修复与器官再生提供种子
细胞。
第二节 动物细胞的 形态和特点
• 一、动物细胞的形态
• 二、动物细胞的生理特点
一、动物细胞的形态
细胞的分化（或特化） 形态分化在离体培养同样也存在。 离体培养的细胞分为两类： 贴壁依赖型（anchorage-dependent）和 非贴壁依赖型（anchorage-independent），前
者可简称为贴壁细胞，后者可简称为悬浮细胞。
动物细胞 结构图
• 1、贴壁细胞
特点：支持物 两种形态，即成纤维样细胞型或上皮样细胞型。前 者主要来源于中胚层组织的细胞，生长时呈放射状、 旋涡状或火焰状走行；后者主要来源于外胚层和内 胚层组织的细胞，生长时彼此紧密连接成单层细胞 片。
• （2）组织培养或细胞培养。1885年德国生 理盐水培养鸡胚组织，至1907年，细胞体外 培养宣布进入一个新时代。
• （3）细胞工程学时代。对细胞进行人工改造及培养 以使其为人类服务的时代，包括真核细胞的基因重组、 导入、扩增和表达的理论和技术，细胞融合的理论和 技术，细胞器特别是细胞核移植的理论和技术，染色 体改造的理论和技术，转基因动、植物的理论和技术， 细胞大量培养的理论和技术，以及产物分离纯化的理 论和技术。
鸡胚细胞、原代兔肾或鼠肾细胞、淋巴细胞 费钱费劳力
• 2、二倍体细胞系：原代细胞经过传代、筛选、 克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并 纯化出某种具有一定特征的细胞株。
• WI-38、MRC-5、2BS等
• 3、转化细胞系：失去了正常细胞的特点，可 以无限增殖。
• 自发转化、人为转化
• Namalwa、CHO、BHK-21、Vero等。 • 各单位细胞库保存
• 2、悬浮细胞
这类细胞的生长不依赖支持物表面，可在培养 液中呈悬浮状态生长，如血液的淋巴细胞和用以生 产干扰素的Namalwa细胞等，细胞呈圆形。
• 3、兼性贴壁细胞
兼具上述两种生长方式的细胞，称为兼性贴 壁细胞，如CHO细胞、小鼠L929细胞。当它们 贴附在支持物表面上生长时呈上皮或成纤维细 胞的形态，而当悬浮于培养基中生长时则呈圆 形，但有时它们可相互支持贴附在一起生长。
张忠山 生命科学学院
• 一、概述 • 二、动物细胞的形态和生理特点 • 三、生产用动物细胞的要求和获得 • 四、动物细胞的培养条件和培养基 • 五、动物细胞培养的方法和操作方式 • 六、动物细胞生物反应器及其检测控制系统 • 七、动物细胞制药的前景和展望
第一节 概述
• （1）发现细胞和细胞学说创立。1665年英 国物理学家Hooke通过自制的显微镜观察切 成薄片的软木时看到死细胞的细胞壁。
• 3、正常二倍体细胞的生长寿命是有限的
• 当细胞培养开始，称之为原代培养，经过传代后， 即成为有限细胞系，即有限的生长传代时间，取决 于细胞来源的种族和年龄，人胚成纤维细胞约可培 养50代，鸡胚的30代，小鼠的8代。但是若向培养 基中加入表皮生长因子，可使上皮细胞的寿命从原 来的50代增加至150代。
• 6、动物细胞蛋白合成途径和修饰功能与细菌不 同
• 场所：游离的核糖体以及粗面内质网上的核糖体， 前者合成的蛋白质都用于细胞质基质内，后者上 合成的蛋白质是分泌性的和膜中的整合蛋白，多 数为糖蛋白。
• 蛋白质上的糖链有的在内质网上加接，有的在高 尔基体中加接。其中内质网中加接的是N-链寡糖， 在高尔基体内加接的是O-链寡糖。
• 当细胞突变为异倍体后，该细胞可转变成无限细胞 系，或称连续细胞系。
动物细胞培养一代生长过程
4、动物细胞对周围环境比较敏感 无细胞壁保护，因而外界的物理化学因素很容易
产生影响。
5、动物细胞培养基的要求高 与细菌和植物细胞不同，其需要12种必需氨基酸、
8种以上的维生素、多种无机盐和微量元素、作为 主要碳原的葡萄糖以及多种细胞生长因子和贴附因 子，而且不同种类要求又有变化。
二、动物细胞的生理特点
• 1、细胞的分裂周期长 一般为12~48h，细胞分裂周期=间期（G1期+S 期+G2期）+分裂期（M期）
G1期：凡细胞无增殖活动时皆滞留在G1期 S 期：DNA的合成，一般为6~8小时
• G2期：DNA量加倍，RNA合成和染色体螺旋 化，持续时间短，一般为2~5h。
• M期：一般持续时间很短，仅0.5~1h。相当于 有丝分裂的中后期和末期，主要是染色体的 变化、分裂，并形成子细胞。
• 细胞分裂代数与培养中的代数及相互关系。
• 2、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现 象
• 大多数正常二倍体（dipoid）细胞的生长都需 要一定的基质（如玻璃，塑料等）上贴附， 伸展后才能生长增殖，其机制可能与电荷、 钙镁离子的作用以及许多贴附因子有关。
• 当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时， 细胞与其周围细胞相互接触时，细胞才停止 增殖。保持一定的营养，细胞仍可存活一段 时间，但细胞密度不再增加，该现象就称为 接触抑制或密度依赖抑制现象。一旦细胞转 化为异倍体后，该现象消失，细胞可多层生 长，细胞密度可大大增、产量低。 • 优点：分泌胞外、纯化方便、翻译后修饰糖
基化，与天然产品一致。
第三节 生产用动物细胞的要求 和获得
• 一、生产用动物细胞的要求 • 二、生产动物细胞的获得 • 三、常用生产用动物细胞的特性 • 四、基因工程细胞的构建和筛选 • 五、细胞库的筛选
传代细胞的要求
• 正常原代细胞 二倍体细胞 无限制 • 癌细胞生产药物需谨慎！
一、生产用动物细胞的要求
• （1）原代正常组织分离的细胞 • （2）二倍体细胞，即使是传代细胞 • （3）传代细胞用于生产 • （4）按照FDA对细胞株的要求，控制最终
产品中DNA残留量。
• 1、原代细胞：是直接取自动物组织、器官， 经过粉碎、消化而获得的细胞悬液。一般1g 组织约有109个细胞。
• （4）细胞工程制药成为现代制药技术中常用的手段。
应用领域
• 生产药品：作为宿主细胞表达生产原核细胞 所不能生产的药用蛋白。
• 基础研究的细胞材料：细胞模型 • 种子细胞：为组织修复与器官再生提供种子
细胞。
第二节 动物细胞的 形态和特点
• 一、动物细胞的形态
• 二、动物细胞的生理特点
一、动物细胞的形态
细胞的分化（或特化） 形态分化在离体培养同样也存在。 离体培养的细胞分为两类： 贴壁依赖型（anchorage-dependent）和 非贴壁依赖型（anchorage-independent），前
者可简称为贴壁细胞，后者可简称为悬浮细胞。
动物细胞 结构图
• 1、贴壁细胞
特点：支持物 两种形态，即成纤维样细胞型或上皮样细胞型。前 者主要来源于中胚层组织的细胞，生长时呈放射状、 旋涡状或火焰状走行；后者主要来源于外胚层和内 胚层组织的细胞，生长时彼此紧密连接成单层细胞 片。
• （2）组织培养或细胞培养。1885年德国生 理盐水培养鸡胚组织，至1907年，细胞体外 培养宣布进入一个新时代。
• （3）细胞工程学时代。对细胞进行人工改造及培养 以使其为人类服务的时代，包括真核细胞的基因重组、 导入、扩增和表达的理论和技术，细胞融合的理论和 技术，细胞器特别是细胞核移植的理论和技术，染色 体改造的理论和技术，转基因动、植物的理论和技术， 细胞大量培养的理论和技术，以及产物分离纯化的理 论和技术。
鸡胚细胞、原代兔肾或鼠肾细胞、淋巴细胞 费钱费劳力
• 2、二倍体细胞系：原代细胞经过传代、筛选、 克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并 纯化出某种具有一定特征的细胞株。
• WI-38、MRC-5、2BS等
• 3、转化细胞系：失去了正常细胞的特点，可 以无限增殖。
• 自发转化、人为转化
• Namalwa、CHO、BHK-21、Vero等。 • 各单位细胞库保存
• 2、悬浮细胞
这类细胞的生长不依赖支持物表面，可在培养 液中呈悬浮状态生长，如血液的淋巴细胞和用以生 产干扰素的Namalwa细胞等，细胞呈圆形。
• 3、兼性贴壁细胞
兼具上述两种生长方式的细胞，称为兼性贴 壁细胞，如CHO细胞、小鼠L929细胞。当它们 贴附在支持物表面上生长时呈上皮或成纤维细 胞的形态，而当悬浮于培养基中生长时则呈圆 形，但有时它们可相互支持贴附在一起生长。