GBT_4789[1].40-2010_食品卫生微生物学检验_阪崎肠杆菌检验标准培训资料

USFDA 方法 （一） （一）USFDA
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• •
优点：所使用的各种培养基常见、价格便宜，更易普及。 缺点：选择性差
：竞争性抑制作用 1. EE broth broth：竞争性抑制作用 2. VRBGA ：（ 1）其它细菌也能生长，产生粉紫色菌落，胆 VRBGA：（ ：（1 2）ES 无特征性菌落，不易 汁酸沉淀形成紫色晕圈；（ 汁酸沉淀形成紫色晕圈；（2 ES无特征性菌落，不易 ES 和其他微生物 区别 区别ES ES和其他微生物 3. TSA:多种产生黄色素沉着的肠杆菌科菌株均能生长，如： pantoea spp .，E. hermanii，E. vulneris。 spp.
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五、增殖能力
℃，37 ℃分别是 13.7h ，1.7h ，19 －21min 。 • 6℃，21 21℃ 37℃ 分别是13.7h 13.7h， 1.7h， 19－ 21min。 发现，与本底相比， 25 ℃放置 6h 该菌的相对危险 • MRA MRA发现，与本底相比， 发现，与本底相比，25 25℃ 放置6h 6h该菌的相对危险 30 倍； 25 ℃放置 10h 可增加 30 000 倍。 性可增加 性可增加30 30倍； 倍；25 25℃ 放置10h 10h可增加 可增加30 000倍。 年2月FAO/WHO 在日内瓦召开的婴儿配方粉中 ES • 2004 2004年 FAO/WHO在日内瓦召开的婴儿配方粉中 在日内瓦召开的婴儿配方粉中ES ES （＜ 3 专家研讨会上提出婴儿配方粉中微量的 专家研讨会上提出婴儿配方粉中微量的ES ES（＜ （＜3 CFU/100g ）污染也能导致感染的发生。 CFU/100g）污染也能导致感染的发生。
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五五��世世界界范范围围内内 感感染染情情况况
中国CDC营养食品所
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第三部分 食品卫生微生物学检验 阪崎肠杆菌检验
主要内容
一、制订的主要依据 《食品卫生微生物学检验 阪崎肠杆菌检验 》 二、 二、《 阪崎肠杆菌检验》
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一、制订的主要依据
1. ISO 2006年“乳和乳制品中阪崎肠杆菌的检测”（Milk and milk products—Detection of Enterobacter sakazakii ）方法； 2. 美国FDA 2002年颁布的“婴儿配方粉中阪崎肠杆菌的分离和 计数”（Isolation and Enumeration of Enterobacter sakazakii from Dehydrated Powdered Infant Formula ）方法； 3. 2004年荷兰乳及乳制品控制中心对各种阪崎肠杆菌检测方法 的比较研究； 4. 雀巢研究中心2005年环境样品中阪崎肠杆菌快速检测方法； 5. 阪崎肠杆菌快速检测培养基DFI研究资料。
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显色培养基的特点
α-葡萄糖苷酶活性
指示剂：
1. -α，D吡喃葡糖甙（ XαGlc ） 5-溴-4-氯-3-吲哚 吲哚D-吡喃葡糖甙（ 吡喃葡糖甙（X Glc）
甲基伞形酮 -α-D葡糖苷（α-MUG ） 2. 44-甲基伞形酮 甲基伞形酮-D-葡糖苷（ -MUG） 3. 4邻硝基苯 -α-D吡喃葡糖甙 4-邻硝基苯 邻硝基苯-D-吡喃葡糖甙
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第一部分：一般特征
命名 一、 一、命名 二、 培养特征 二、培养特征 生化反应 三、 三、生化反应 抵抗力 四、 四、抵抗力 增殖能力 五、 五、增殖能力 致病性 六、 六、致病性
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一、命名
1980 年之前一直被称为 黄色 阴沟肠杆菌 。 1980年之前一直被称为 年之前一直被称为黄色 黄色阴沟肠杆菌 阴沟肠杆菌。 杂交 DNA-DNA DNA-DNA杂交 生化反应 黄色素 抗生素敏感性
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阪崎肠杆菌检测方法的比较
• 2005年从10个省（市）的零售或批发市场采集的 194份配方粉。FDA定性检 测检出4个阳性样本， ISO定性检测检出 5个，其中4个在第一法的检测中均 为阳性，另一阳性检出样品在第一法中的检测结果为阴性。 选择性分离平板上分离株的菌落特征和样品数量
GB/T 4789.40-2010 食品卫生微生物学检验 008
食品卫生微生物学检验
阪崎肠杆菌检验
Enterobacter sakazakii (ES) sakazakii(ES)
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Enterobacter sakazakii (ES) sakazakii(ES)
内 容
第一部分：一般特征 第二部分：流行病学特征 ES 的检验 第三部分： 第三部分：ES ES的检验
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婴儿配方粉中 ES 的安全性问题，已成为全球关注的焦 婴儿配方粉中ES ES的安全性问题，已成为全球关注的焦 点。 年ICMSF 把ES 列为 “严重危害特殊人群，威胁生命、 • 2002 2002年 ICMSF把 ES列为 列为“ ”的一种病原菌。 导致慢性实质性后遗症或长期影响 导致慢性实质性后遗症或长期影响” 年2月FAO/WHO 在日内瓦召开的婴儿配方粉中 ES 专家研 • 2004 2004年 FAO/WHO在日内瓦召开的婴儿配方粉中 在日内瓦召开的婴儿配方粉中ES ES专家研 ES 列为婴儿配方粉中仅有的两种 A类致病菌（沙门 讨会： 讨会：ES ES列为婴儿配方粉中仅有的两种 列为婴儿配方粉中仅有的两种A 和阪崎）之一。
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六、致病性
婴儿： 1. 脑膜炎 2. 坏死性小肠结肠炎 3. 菌血症 • 严重的神经系统后遗症
成人：局部感染、菌血症、 术后骨髓炎 成人：局部感染、菌血症、术后骨髓炎
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第二部分：流行病学特征
内 容
ＥＳ的分布 一、 一、ＥＳ的分布 易感人群和引起中毒的食物 二、 二、易感人群和引起中毒的食物 三、 婴儿配方粉中 ES 的污染状况 三、婴儿配方粉中 婴儿配方粉中ES ES的污染状况 食物中 ES 的来源及中毒发生的原因 四、 四、食物中 食物中ES ES的来源及中毒发生的原因 世界范围内感染情况 五、 五、世界范围内感染情况
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一、ＥＳ的分布
环境 1. 1.环境 原油、切削液、苍蝇、食品加工厂（奶制品、谷类、 巧克力、马铃薯粉、意大利面制品）、医院（空气、 听诊器、临床用品）、家庭、温泉、鼠、植物根围、 沉积物，沼泽地、土壤 食品及其相关用品 2. 2.食品及其相关用品 啤酒杯、干酪、婴儿配方奶粉和豆粉、婴儿配方粉冲 调用品（搅拌器、勺子、瓶刷）、普通奶粉、碎牛肉、 肉类、香肠、盐腌肉、发酵面包、豆腐、蔬菜、水 （管道，生物膜）、谷类、蔬菜、豆类制品、调味品
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ISO 方法 （二） （二）ISO
检 样 1：10 BPW 稀释 36±1℃，18±2h 0.1ml + mLST-Vm 10ml 44±0.5℃，24±2h ESIA 44±1℃，24±2h 挑取蓝绿色菌落 TSA 25±1℃，48～72h 挑取黄色菌落 氧化酶试验 报 告 生化鉴定 生 化 鉴 定
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四、食物中 ES 的来源及中毒发生的原因 四、食物中ES ES的来源及中毒发生的原因
目前公共卫生关注的婴儿配方中 ES 的来源包括以下 2种情况： 目前公共卫生关注的婴儿配方中ES ES的来源包括以下 的来源包括以下2 � 二次污染。 内在污染 —— ——二次污染。 如：加工环境中微生物的存在；加工装置内表面微生物 的存在；热处理后，与干燥基粉混合的加入成分中存在的微 生物。 � 外源性污染 —— 配方粉调制环境和调制器皿。 外源性污染—— ——配方粉调制环境和调制器皿。 污染的配方粉或调制配方在较高温度下存放，食用 受ES ES污染的配方粉或调制配方在较高温度下存放，食用 前不加热，或加热不彻底，喂食时间较长等都可导致 ES 有机 前不加热，或加热不彻底，喂食时间较长等都可导致ES ES有机 会生长繁殖，增加患病的危险性。
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主要感染渠道 ！！！
虽然现在还不能确 的宿主和传播模 定ES ES的宿主和传播模 型，但在多起新生儿 感染事件的调查中 ES ES感染事件的调查中 发现婴儿配方粉是主 要的感染渠道。
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产品召回
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ES 的污染状况 三、婴儿配方粉中 三、婴儿配方粉中ES ES的污染状况
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三、生化反应
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注：＋ ：90-100％；(＋) ：75-89%； V ：25-74％；(－)：10 -24％；－ ：0-9％
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四、抵抗力
• 耐热性 • 渗透压 • 干燥
巴氏消毒 过 不同菌株的耐热性存在明显的差别，但标准的 不同菌株的耐热性存在明显的差别，但标准的巴氏消毒 巴氏消毒过 ES 。 程能有效的灭活 程能有效的灭活ES ES。 对渗透压的耐受性使该菌能够成为环境中的优势株，增 ES ES对渗透压的耐受性使该菌能够成为环境中的优势株，增 加婴儿配方粉加工后污染的危险性，使其在婴儿配方粉中长期 存活。
• • • •
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二、培养特征
℃范 • G－无芽孢杆菌，兼性厌氧，在6℃-47 -47℃ ℃ 围内均可生长，适温35-37 35-37℃ • 营养要求不高： VRBGA、TSA、NA、MAC、EMB、其他
与其他常见肠杆菌相似
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培养温度
�
已调制配方奶中ES（n＝27）在不同温度下的生长 率（Iversen et al. (2004b); Zwietering personal communication, 2004）。
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生长特征
ES 在VRBGA 平板上首次划线分离时， 37 ℃培养 24h ES在 VRBGA平板上首次划线分离时， 平板上首次划线分离时，37 37℃ 培养24h 2种不同的形态学特征： 可生成 可生成2 1. 干燥或粘液状、圆锯齿状（凹口或锯齿），用金属环 接触时可发现坚韧或有弹力，即粘贴金属环的菌量很 少，并且菌落可很快恢复。传代培养后可能会转变为 典型的光滑菌落。 2. 光滑、易于用金属环从菌落移取细胞。
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本实验室研究结果
1. 大多数分离株呈流蜡样，粉紫色、 圆形、光滑、凸起、饱满，并散发 出特殊气味； 2. 3. 干燥、顶端发白的粉紫色菌落； 从配方粉中初次分离到的该菌在 平板上过夜培养后呈现特殊 VRBGA VRBGA平板上过夜培养后呈现特殊 的菌落形态：菌落干燥、边缘有褶 皱，极富弹性。传代后，菌落皱褶 减少，延长培养时间，可见皱褶逐 渐增加。选择性分离
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优点：
mLST -Vm ；ESIA 选择性强： 选择性强：mLST mLST-
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缺点：
ES 显色培养基（ ESIA ）价格较高 ES显色培养基（ 显色培养基（ESIA ESIA）价格较高
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（三）常见选择性培养基
Oxoid , UK) • DFI ( (Oxoid Oxoid, • ESIA (AES, France) ，Switzerland ） • R＆F（R&F Laboratories Laboratories， Switzerland） • OK medium CES (Merck, • 其他：国内阪崎肠杆菌显色培养基、 其他：国内阪崎肠杆菌显色培养基、CES ，NA+ α-MUG Germany) Germany)，
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二、易感人群和引起中毒的食物
1961 年， Franklin 等， • 首次报道病例： 首次报道病例：1961 年，Franklin 脑膜炎 50% ，20-50 % • 死亡率： 死亡率：50% 50%，
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易感人群
可引起各年龄段的感染，但从报道病例的年龄 • ES ES可引起各年龄段的感染，但从报道病例的年龄 <1 岁的儿 分布来看，高危人群主要是婴儿（即 分布来看，高危人群主要是婴儿（即<1 <1岁的儿 童），新生儿（ ≤28 天）、尤其是早产儿、低出 童），新生儿（≤ 28天）、尤其是早产儿、低出 免疫力低下 的婴儿，发生严重感染的危 生体重或 生体重或免疫力低下 免疫力低下的婴儿，发生严重感染的危 ，死亡率： 50% ，20-50 % 。 险性最高 险性最高， 死亡率：50% 50%， HIV 阳性的婴儿 • 母亲 母亲HIV HIV阳性的婴儿 术后骨髓炎等 • 成人：局部感染、菌血症、 成人：局部感染、菌血症、术后骨髓炎等