淋巴细胞功能测定

免疫学技术原理与应用

PAIT-12

淋巴细胞功能测定

孙汭

中国科技大学生命科学学院

免疫学研究所

PMIT-12

淋巴细胞功能测定

一、常用的淋巴细胞功能测定

二、T淋巴细胞功能测定

三、B淋巴细胞功能测定

四、NK细胞细胞毒试验

一、常用的淋巴细胞功能测定

1、淋巴细胞增殖试验

① 3H-TdR掺入法

原理：淋巴细胞在丝裂原或特异性抗原刺激下转化为淋巴母细胞，发生转化过程中，细胞DNA合成大量增多。此时在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-Thymidine riboside, 3H-TdR), 使3H-TdR掺入新合成的DNA中，经β-液体闪烁仪检测淋巴细胞DNA 的3H-TdR掺入量，根据掺入细胞内的核素的量可判断淋巴细胞增殖的程度。

② MTT比色法

原理：MTT（（3-4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑）是一种黄色可溶性噻唑盐，掺入细胞后，在细胞活化增殖时通过线粒体能量代谢过程，MTT代谢形成蓝色的甲攒（Formazan)沉积于细胞内或细胞周围，形成甲攒的量与细胞增殖程度成正相关。甲攒经异丙醇溶解后呈紫蓝色，借助酶标仪测定OD值，可反映细胞增殖水平。

2、细胞毒试验

①51Cr释放法

原理：用放射性核素51Cr（Na251-CrO4，鉻酸钠）标记靶细胞，51Cr即可进入靶细胞，与胞浆蛋白结合。然后将51Cr标记的靶细胞与待检细胞（效应细胞）共同孵育一定时间后，若待检细胞能够杀伤靶细胞，则51Cr从靶细胞释放出来。51Cr的释放量与效应细胞的活性成正相关。即靶细胞被杀伤的越多，释放到上清中的游离51Cr越多，用γ计数仪测定上清中51Cr的放射活性（cpm）值，以计算待检细胞的细胞毒活性。

（一）、用51Cr铬酸钠标记靶细胞

1．用RPMI-1640培养液洗涤107靶细胞，去上清液。用0.5ml不含碳酸氢钠的完全培养液悬浮细胞。加入100μCi（3.7MBq）51Cr铬酸钠，37℃水浴中标记1小时，每5～10分钟摇晃一次，混匀细胞。

2．用RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次400×g 10分钟。用50ml RPMI-1640培养液悬浮细胞，置37℃水浴30分钟，以减少非特异的自然释放。

3．离心200×g 10分钟，去上清液。小心用RPMI-1640培养液悬浮细胞，尽量减少振荡引起的细胞损伤以降低靶细胞的自然释放率，将细胞浓度调整为0.5×105或1×105/ml备用。

（二）、4小时51Cr释放实验

1．在96孔圆底细胞培养板中加入51Cr标记的靶细胞，每孔加100μl。

2．向各孔加100μl效应细胞，效应细胞与靶细胞的比例（效靶比，E：T）根据要求而定，通常为5：1～50：1。阴性对照孔（自然释放）不加效应细胞只加100μl完全培养液，阳性对照孔（最大释放）中加100μ1％NP40（或2％SDS，1mol/L盐酸）。每个实验置三个复孔。

3．稍稍离心培养板（100×g 3分钟）后，置37℃5％ CO2的二氧化碳培养箱中培养4小时。

（三）、放射性活性（cpm) 测定和特异性杀伤活性的计算

离心培养板200×g 10分钟，每孔吸出100μl上清液置一次性使用的检测管中，在γ－计数仪上（或液闪计数仪上）测定上清液中的每分钟放射性活性（cpm值）。

（实验组cpm－自然释放组cpm）

细胞毒性（％）＝×100％

（最大释放组cpm－自然释放组cpm）

② CFSE法

原理：根据CFSE 和PI两种荧光染料的光谱不重叠的特性，用流式细胞仪在FL1 和FL3 通道可区分CFSE 和PI (碘化丙碇)，用CFSE 和PI 同时标记靶细胞, CFSE标记靶细胞, PI 标记DNA，如果细胞膜已破坏的靶细胞则PI+。E：T为50∶1～25∶1 ,共孵育2～4h,流式细胞仪收集1 000 个靶细胞并测定被杀细胞的百分率。

优点：CFSE/PI 双荧光染料标记的流式细胞分析检测细胞毒具有多个优点:避免放射性试剂的应用,敏感性增强,单细胞水平的分析。

（一）、用CFSE标记靶细胞

YAC-1 cells was used as targets. Target cells were labelled with CFSE for 10 min at 37 ◦C and 5% CO2 using a final concentration of 7.5mmol/l. After labelling, the cells were washed once and diluted in CM.

（二）、杀伤实验

Effector (E) and target (T) cells were mixed to a final volume of 200 μl in CM 10 ng rrIL-2 was added to all tubes except control samples with target cells only. The tubes were mixed and spun down at 120×g for 2 min. The samples were incubated in a water bath at 37 ◦C and 5% CO2 for 18–20 h.

At the end of the incubation time, the samples were put in an ice water bath and 50 μl, 50 μg/ml, propidium iodide (PI) (Sigma, Sweden) was added for DNA labelling of dead cells. The samples were then incubated for 5 min and analysed by flow-cytometry within 60 min.

Percentm specific target cell death

dead targets in the sample (%) − spontaneously dead targets (%) (cytotoxicity%) = × 100

100 − spontaneously dead targets (%)

The proportion of spontaneously dead targets normally varies between 2 and 7%

二、T淋巴细胞功能测定

1、T淋巴细胞增殖试验