基因敲除技术及其进展
基因敲除技术的优势与劣势分析与对比评价与前景展望与预测与前瞻展望
基因敲除技术的优势与劣势分析与对比评价与前景展望与预测与前瞻展望基因敲除技术是一种目前广泛应用于生物学研究和药物开发领域的重要工具。
它通过干扰特定基因的表达，从而揭示基因功能并帮助研究人员理解疾病的发生机制。
本文将对基因敲除技术的优势、劣势进行分析与对比评价，并展望其未来的发展前景。
首先，基因敲除技术的优势之一是能够直接改变目标基因的DNA序列，从而达到完全失活的效果。
相比其他基因编辑技术，如基因编辑酶等，基因敲除技术能够高效地突变目标基因，避免了需改变具体位点的限制。
这使得基因敲除技术更加灵活、易于操作。
其次，基因敲除技术可以帮助研究人员确定基因的功能和生理作用。
通过敲除目标基因，研究人员可以观察到该基因在生物体内的影响，例如疾病模型中敲除特定基因后是否出现相应的疾病表型。
这有助于揭示基因对生物体的影响机制，是功能基因研究的重要手段。
此外，基因敲除技术还可以用于药物研发和治疗策略的发展。
通过敲除某些疾病相关基因，研究人员可以模拟和研究疾病发生机制，寻找可能的治疗靶点。
这为药物研发提供了新的思路和选择，并可以用于筛选潜在的治疗靶点和药物效果评估。
然而，基因敲除技术也存在一些劣势和挑战。
首先，基因敲除是一种非常粗糙的方法，它不能精确地敲除目标基因的所有亚型或突变，可能会导致一些并发症或不可预测的效果。
这限制了基因敲除技术在一些特定研究领域的应用。
其次，基因敲除技术在体内和体外试验中难以实现目标基因的全面敲除。
由于机体组织和胚胎发育的复杂性，以及细胞分裂和自我修复机制的存在，对于一些目标基因，完全敲除是一项挑战。
这可能会导致实验结果的不确定性，并限制了基因敲除技术在某些实际应用中的可行性。
虽然基因敲除技术具有一些劣势，但其在生物学研究和药物开发中的重要性不可忽视。
随着技术的不断发展和突破，相信基因敲除技术将会逐渐克服这些劣势并取得更好的表现。
未来，基因敲除技术有望在许多领域展现出更大的前景。
首先，基因敲除技术将在治疗疾病和发展个性化医疗方面扮演重要角色。
基因敲除技术及其进展
基因敲除技术研究进展及其在代谢工程上的应用The Current Status of Gene Knockout and its Application in MetabolicEngineering天津大学化工学院二零壹六年六月摘要基因敲除技术是20世纪80年代发展起来一项重要的分子生物学技术，在微生物代谢工程，动植物改造以及功能基因研究方面具有广泛的应用。
本文介绍了基因敲除的策略和在代谢工程中的作用，着重介绍了四种新兴的基因敲除策略：RNAi，ZFN，TALENs以及最近研究火热的CRISPR/Cas9。
并在最后展望了基因敲除技术尤其是新兴技术在相关领域的发展趋势，为基因敲除技术的进一步发展提供了参考。
关键词：基因敲除代谢工程同源重组CRISPR/Cas9ABSTRACTGene Knockout is an important molecular biotechnology which has developed sine 1980. It has been proved efficient in microbial metabolic engineering, transform of nimals and plants and functional genomics. In this review, we mainly introduced the strategies of gene knockout and its application in metabolic engineering.And four new strategies RNAi, ZFN, TALENs and CRISPR/Cas9 were highlighted in detail. At last, developing frontiers and application prospects of gene knockout were further discussed.KEY WORDS：gene knockout, metabolic engineering, homologous recombination, CRISPR/Cas9目录第一章基因敲除技术 (1)1.1基因敲除相关背景 (1)1.2基因敲除技术在代谢工程中的应用 (2)第二章基因敲除策略 (3)2.1传统的基因敲除策略 (3)2.1.1利用同源重组进行基因敲除 (3)2.1.2利用随机插入突变进行基因敲除 (4)2.2新兴的基因敲除策略 (5)2.2.1 利用RNA干扰引起的基因敲除 (5)2.2.2 锌指核酸酶基因打靶技术 (5)2.2.3 TALENs 靶向基因敲除技术 (6)2.2.4 CRISPR/CAS9基因敲除技术 (7)第三章前景展望 (9)参考文献 (10)致谢 (11)第一章基因敲除技术1.1基因敲除相关背景随着测序技术的迅速发展，生物体基因功能的研究已经成为当下最热门的课题。
基因敲除技术在神经生物学中的应用研究
基因敲除技术在神经生物学中的应用研究第一章引言基因敲除技术是一种重要的基因编辑方法。
它可以利用RNA干扰或利用DNA重组技术在细胞或生物体中敲除目标基因。
这项技术在生物学研究中广泛应用，特别是在神经生物学领域中。
它为研究神经系统疾病、神经系统功能和形态发育提供了一种有力的工具。
本文将介绍基因敲除技术在神经生物学研究中的应用与进展。
第二章基因敲除技术概述基因敲除技术是一种利用RNA干扰或DNA重组技术创造基因缺失的方法。
RNA干扰可以利用RNA分子干扰到mRNA的翻译，以达到抑制目标基因表达的效果。
DNA重组技术则可通过缺陷修复机制实现基因引入缺失。
这种技术已经被应用于多种有脊椎动物的模式动物中，包括果蝇、鼠、猕猴等。
第三章基因敲除技术在神经系统疾病中的应用基因敲除技术在神经系统疾病研究中发挥了重要作用。
例如，研究鼠的致密性镁离子缺乏症，这种疾病是一种神经系统疾病，病因是基因突变导致的镁离子通道异常。
通过基因敲除技术，发现没有该基因的小鼠出现了类似镁缺乏症的症状，这为该疾病的研究提供了新方法。
第四章基因敲除技术在神经系统发育中的应用基因敲除技术在神经系统发育研究中也得到广泛应用。
通过敲除基因，可以研究基因在神经系统发育过程中的作用。
例如，在小鼠模型中敲除了酰化蛋白基因的等位基因，在这些小鼠中，神经元移动能力发生显著改变，这表明了酰基化蛋白对于神经元发育过程起到了重要作用。
第五章基因敲除技术在神经系统功能研究中的应用基因敲除技术在神经系统功能研究中也具有重要作用。
例如，在小鼠模型中敲除了神经可塑性相关蛋白基因。
结果表明，此时小鼠的记忆和学习功能出现了明显的缺陷。
这种技术的发展，使得科研人员能够针对某一具体的基因进行研究，而不必涉及复杂的分子网络和细胞信号系统。
第六章基因敲除技术限制尽管基因敲除技术在神经生物学研究中发挥了重要作用，但是其应用还受到一些限制。
首先，该技术可能会导致副作用，因此需要仔细进行基因敲除操作。
基因敲除技术路线
基因敲除技术路线基因敲除技术是一种常用的基因组编辑方法，通过破坏特定基因的功能，以研究该基因在生物体发育、生理和病理过程中的作用。
本文将介绍基因敲除技术的基本原理、常用的敲除方法和技术路线。
一、基因敲除技术的原理基因敲除是指通过人为手段使特定基因在生物体中失去功能。
在细胞层面上，基因敲除可以通过两种方式实现：直接破坏基因编码区域或间接影响基因表达。
直接破坏基因编码区域的方法包括插入缺失、替换和故障等，而间接影响基因表达的方法则通过RNA干扰或基因废弃等方式实现。
二、常用的基因敲除方法1. 全基因敲除方法：全基因敲除是将整个基因组中的某个特定基因进行敲除，即完全破坏该基因的编码区域。
常用的全基因敲除方法包括基因敲除小鼠模型、转基因植物敲除和CRISPR-Cas9等。
2. 特定基因敲除方法：特定基因敲除是指对某个特定基因进行有针对性的敲除，保留其他基因的功能不受影响。
常用的特定基因敲除方法包括siRNA靶向敲除、基因编辑酶的使用和肌肉纤维母细胞的敲除等。
三、基因敲除技术路线基因敲除技术的路线可以分为以下几个步骤：1. 确定目标基因：首先需要确定要敲除的目标基因。
通过文献研究和生物信息学分析，可以确定该基因在生物体发育、生理和病理过程中的作用，以及敲除后可能引起的变化。
2. 设计敲除载体：根据目标基因的序列信息，设计敲除载体。
敲除载体通常包括靶向序列、选择性标记基因和背景基因等。
靶向序列用于特异性识别目标基因，选择性标记基因用于筛选敲除细胞，背景基因用于确认敲除效果。
3. 转染敲除载体：将设计好的敲除载体导入到目标细胞中。
常用的转染方法有化学法、电穿孔法和病毒载体介导法等。
转染后，目标细胞中将存在敲除载体和非敲除细胞。
4. 筛选敲除细胞：通过添加相应的筛选剂或选择标记基因，筛选出成功敲除目标基因的细胞。
敲除细胞可以通过PCR、Western blot 或克隆等方法进行鉴定。
5. 验证敲除效果：通过对敲除细胞进行功能性实验，验证敲除效果。
基因敲除的技术发展
基因敲除的技术发展随着科技的不断发展，人们对基因敲除的技术也越来越感兴趣。
基因敲除是指通过特定的方法，将细胞中的某个基因序列在DNA水平上进行删减或修改，从而改变其所编码蛋白质的表达，进而影响细胞的功能。
随着基因敲除的技术不断的发展，其在医学、生物学、农业等领域的应用也越来越广泛。
一、基因敲除技术的历史基因敲除技术源于20世纪70年代，当时人们的基因改造还停留在单细胞生物体的范围内。
并且，由于技术的不成熟，难以进行大规模和高效率的基因改造。
随着一系列技术的不断进步，如锌指核酸酶技术、CRISPR/Cas9系统等，基因敲除技术得到了重大的突破。
二、基因敲除技术的原理基因敲除技术的基本原理就是通过特定的手段将目标基因“剪切”掉，之后由细胞自行修复或通过外部实验手段再将其修改或改变。
具体而言，基因敲除技术包含两个关键步骤：基因切割和细胞DNA修复。
三、基因敲除技术在医学领域的应用基因敲除技术在医学领域有着广泛的应用，尤其是在基因治疗中。
基因治疗是指通过修改、替换或添加单个或多个基因，以纠正或治疗遗传性疾病的一种新型治疗方法。
其中，基因敲除技术是基因治疗中最常用的手段之一。
利用基因敲除技术，可以消除疾病基因的影响，从而治疗疾病。
四、基因敲除技术在生物学领域的应用基因敲除技术在生物学领域的应用也非常广泛，可以用来研究生物的基本生命过程、发育和疾病机制等，为人类解决一系列生命科学问题提供了更好的手段。
例如，基因敲除技术可以用来研究一些不容易获得的疾病模型，如人体器官和组织的发生和发育，从而为相关疾病的研究提供基础数据。
五、基因敲除技术在农业领域的应用基因敲除技术在农业领域的应用也非常广泛，可以用来改良作物、提高其产量和品质。
例如，基因敲除技术可以用来改良作物的营养成分、抗病性等，从而提高作物的产量和品质。
总的来说，基因敲除技术的发展，使得人们在医学、生物学、农业等领域中有更多的选择和可能性，为人类未来的发展带来更多的机遇和挑战。
基因敲除小鼠技术
转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。
尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。
二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。
同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
基因敲除技术及其在疾病治疗中的研究进展
基因敲除技术及其在疾病治疗中的研究进展随着科技的不断进步，基因敲除技术在治疗疾病方面发挥着越来越重要的作用。
基因敲除技术是利用RNA干扰或基因编辑技术对目标基因进行敲除，从而达到治疗疾病的目的。
这项技术具有精准性、高效性和可控性等优点，已成为当前基因治疗领域研究的热点之一。
本文将对基因敲除技术的研究进展进行简要介绍。
基因敲除技术的原理是通过RNA干扰或基因编辑技术来降低或完全抑制目标基因的表达，达到治疗疾病的目的。
RNA干扰是指利用RNA分子在细胞内靶向特定基因mRNA的过程，从而达到抑制该基因的表达。
基因编辑技术是指将DNA序列通过核酸酶切割、插入、替换等方式进行修饰的技术，如ZFN、TALENS和CRISPR/Cas9等技术工具。
这些方法可以直接接触基因，通过改变DNA序列来制造生物体的具体变化。
通过RNA干扰和基因编辑技术对目标基因进行敲除，可以有效地治疗多种疾病，如肝癌、血友病和乳腺癌等。
基因敲除技术在治疗肝癌方面的研究表明，RNA干扰可以有效地降低肝癌中的靶向基因表达水平，从而影响肝癌细胞的正常生长和增殖。
此外，针对肝癌治疗的实验也证明了CRISPR/Cas9技术的潜力。
研究人员利用CRISPR/Cas9技术对目标基因进行编辑，从而降低肝癌细胞中该基因的表达水平，促进肝癌细胞的自我凋亡。
除了肝癌外，基因敲除技术在治疗血友病中也取得了一定的研究成果。
血友病是一种由于凝血因子缺乏或减少引起的出血性疾病。
针对血友病的治疗主要是采用人体制备的凝血因子，但是这种治疗方法存在着长期注射和感染的风险。
利用基因敲除技术可实现对基因的修改和修饰，将目标基因进行敲除，从而达到治疗血友病的目的。
除此之外，基因敲除技术在治疗乳腺癌、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症等疾病方面也有一定的应用价值。
例如，研究人员通过RNA干扰技术降低乳腺癌细胞中目标基因的表达水平，从而有效抑制肿瘤细胞的生长和扩散。
在治疗帕金森病和肌萎缩性侧索硬化症方面，基因编辑技术也展现出了潜在的疗效。
基因治疗中的基因敲除技术及其应用
基因治疗中的基因敲除技术及其应用基因治疗是一种利用基因工程技术来治疗疾病的新型医疗方法。
基因敲除技术是基因治疗的关键技术之一，它通过引入干扰性RNA或基因编辑工具，针对患者身体内的异常基因进行靶向打击，以实现基因疾病的治疗。
本文将介绍基因敲除技术的基本原理、方法及其在基因治疗中的应用。
基因敲除技术是指通过致使特定基因失活或删除之前定义的区域，来研究近亲气生物中基因的功能，尤其在人类基因组中的应用十分广泛。
基因敲除技术通常包括两种方法：RNA干扰技术和基因编辑技术。
RNA干扰技术是一种用来靶向沉默特定基因表达的方法。
它通过引入干扰性RNA（siRNA或shRNA）来干扰目标基因的转录或翻译，从而使目标基因的表达水平下降。
siRNA是由人工合成的双链RNA构成，可以选择性地降解与其互补的mRNA，使其无法被翻译成蛋白质。
shRNA是一种基因表达载体，可以产生siRNA，并持续地抑制目标基因的表达。
基因编辑技术是一种直接修改基因组的方法，可以实现精确编辑和改变DNA 序列。
基因编辑技术主要包括锌指核酸酶（ZFNs）、转录调节因子样活化基因编辑酶（TALENs）和CRISPR-Cas9系统。
这些工具通过引导靶标DNA序列，切割和修复DNA，来实现基因敲除。
基因敲除技术在基因治疗中具有广阔的应用前景。
首先，基因敲除技术可以用于治疗单基因型遗传疾病。
通过针对致病基因进行敲除，可以恢复受影响的细胞正常功能，从而治疗疾病。
例如，囊性纤维化患者常常携带突变的囊性纤维化转膜调节器（CFTR）基因，通过使用基因敲除技术，可以删除异常CFTR基因，恢复肺部细胞的正常功能。
其次，基因敲除技术还可以用于癌症治疗。
癌症是由于细胞基因突变引起的，因此通过敲除异常基因可以有效抑制肿瘤细胞的增殖。
例如，肿瘤抑制基因TP53的突变在很多类型的癌症中都很常见。
使用基因敲除技术来恢复正常TP53基因的功能，可以促进癌细胞凋亡和抑制其生长。
基因敲除技术及其在生物研究中的应用
基因敲除技术及其在生物研究中的应用近年来，基因敲除技术（gene knockout technology）已成为生物学研究领域中不可或缺的重要技术之一。
该技术能够精确地剔除或破坏细胞或整个生物体中的特定基因，从而实现对基因功能的研究。
本文将重点介绍基因敲除技术的原理、种类以及在生物研究中的应用。
一、基因敲除技术原理1. CRISPR/Cas9技术CRISPR/Cas9技术是一种革命性的基因编辑工具，该技术利用一种具有双链DNA特异性的内切酶（Cas9）和靶向指导介导RNA（sgRNA）定向切割特定位点上的DNA序列，并导致该位点的失活或突变。
CRISPR/Cas9技术可以在较短的时间内实现基因定向编辑，而且其费用相对较低，操作也较简便。
2. 基因减数（Gene Targeting）技术基因减数技术使用过表达的选择标记基因替代靶向基因的一部分或全部，从而影响某个功能位点的进行或基因的表达量。
该技术需要细胞亚群培养、DNA序列的构建以及线性化质粒的导入，较为繁琐。
二、基因敲除技术种类基因敲除技术目前主要包括自然敲除、随机敲除和定向敲除。
1. 自然敲除自然敲除是指基因在自然环境下发生的突变或是某些生物的天然遗传性基因缺失，是基因研究者最早采用的敲除技术，但该方法往往不够精确，且难以回答基因对生物的功能影响和调控机制。
2. 随机敲除随机敲除是指将DNA序列尽可能高概率地插入基因组的某些区域，从而引起敲除。
该方法优点是适用范围广，但结果通常是不确定的，并且有可能影响其他基因的表达。
3. 定向敲除定向敲除技术是指选择一个特定的靶向DNA序列，通过人工方式造成抑制、破坏、缺失等方式敲除基因。
该方法比较精确，能够针对特定位点进行基因改变，但制备成本较高。
三、基因敲除技术在生物研究中的应用基因敲除技术应用非常广泛，其中一些应用如下：1. 基因功能研究通过敲除或采用突变诱导的方式，探索基因的功能、调控机制及其与疾病和发育的相关性。
基因敲除技术研究进展
兰州交通大学化学与生物工程学院综合能力训练Ⅰ——文献综述题目：基因敲除技术研究进展作者：王振宇学号：201207744指导教师：谢放完成日期：2014-7-16基因敲除技术研究进展摘要基因敲除是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
在总结已有研究成果的基础上，本文对基因敲除技术的概况、原理方法应用以及近年来基因敲除技术的研究进展作一个简单的综述。
关键词基因敲除 RNA i生物模型基因置换基因打靶同源重组1. 基因敲除技术简介基因敲除(Gene knockout)是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。
它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。
基因敲除借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法,通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏,使特定基因失活,以研究该基因的功能；或者通过外源基因来替换宿主基因组中相应部分,以便测定它们是否具有相同的功能，或将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。
基因敲除是揭示基因功能最直接的手段之一。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段(即基因打靶),从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展,除了基因打靶技术外,近年来新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有RNA干扰技术,同样也可以达到基因敲除的目的。
简单的说基因敲除是指将目标基因从基因组中删除。
基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。
这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。
尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。
基因敲除技术
基因敲除技术1．概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。
2．实现基因敲除的多种原理和方法：2．1．利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。
80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)：a．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因(胸苷激酶基因)等)的载体上，成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
b．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。
ｃ．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
ｄ．选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率为10－2～10-5，植物的概率为10－4～10－5。
因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。
人类基因敲除技术的研究及其在生物治疗中的应用
人类基因敲除技术的研究及其在生物治疗中的应用随着科技的发展，人类基因敲除技术得到了飞速的发展，成为近年来生物学领域的研究热点。
基因敲除技术可以利用特异性的核酸技术靶向特定基因，从而精确地切断该基因的活性，达到精准治疗疾病的目的。
本文将介绍人类基因敲除技术的原理及其在生物治疗中的应用。
一、基因敲除技术的原理基因敲除技术是基于RNA干扰技术的一种技术。
RNA干扰技术可以抑制基因表达，同时具有非常高的特异性，这使这项技术成为基因敲除技术的基础。
在基因敲除技术中，先合成一种针对目标基因的DNA序列，这种序列被称为siRNA。
siRNA进入细胞后，与RISC结合，经过几个胞内酶的作用，最终形成一个RNA 复合物。
复合物将siRNA和RISC中的某些蛋白质结合，从而切断靶向基因的mRNA分子。
这些分子是编码成蛋白质所必需的mRNA，它们的被切断会导致基因表达受到抑制，进而影响相关的生命现象。
二、基因敲除技术在生物治疗中的应用1、治疗癌症基因敲除技术在肿瘤生物治疗中具有很大的潜力。
针对肿瘤细胞的基因敲除技术主要是通过敲除癌细胞分化、增殖、转移相关的基因。
在临床实验中，基因敲除技术已成功用于治疗结肠癌、黑色素瘤、乳腺癌等多种癌症。
例如，在针对结肠癌的治疗中，利用基因敲除技术，可以精确地敲除肿瘤细胞中的特定基因，如K-ras 和B-raf，从而抑制肿瘤细胞的增殖和分化。
2、治疗遗传性疾病遗传性疾病引起的疾病与单一基因缺陷有关。
基因敲除技术可以通过靶向敲除掉这些缺陷基因来治疗这些疾病。
例如，常见的遗传性疾病之一的地中海贫血，是由于血红蛋白缺陷基因的遗传缺陷引起。
现在的治疗方法是进行骨髓移植，但是这个方法不仅费用高昂，而且有很大的风险。
利用基因敲除技术，可以进一步提高这些基因缺陷疾病的治疗效果。
3、治疗病毒性疾病基因敲除技术也可以用于治疗病毒感染性疾病，例如艾滋病和猝死病毒感染。
这些病毒具有很好的遗传性，且抵御传统药物的方法。
基因敲除技术
基因敲除技术研究进展综述摘要：基因敲除在20世纪80年代发展起来后已经应用到许多领域, 如建立人类疾病的转基因动物模型(糖尿病转基因小鼠、神经缺损疾病模型等)。
这些疾病模型的建立使研究者可以在动物体内进行疾病的研究: 研究发育过程中各个基因的功能, 研究治疗人类遗传性疾病的途径。
关键字：基因敲除；Cre/LoxP系统；基因载体；生物模型1．概述：基因敲除又称为基因打靶, 是指从分子水平上将一个基因去除或替代, 然后从整体观察实验动物,推测相应基因功能的实验方法，是功能基因组学研究的重要研究工具。
是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。
基因敲除已成为当前医学和生物学研究的最热点与最前沿, 并已对生物学和医学的许多研究领域产生深刻的影响, 成为革命性的研究工具, 具有极其重要的理论意义和实践意义。
基于基因敲除技术对医学生物学研究做出的重大贡献，在该领域取得重大进展的三位科学家，70岁的美国人马里奥•卡佩奇（Mario Capecchi）、82岁的美国人奥利弗•史密西斯（Oliver Smithies）和66岁的英国人马丁•埃文斯（Martin Evans）分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。
2.基因敲出技术发展历史80年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。
关于第二代区域和组织特异性基因敲除技术的研究始于1993年。
Tsien等于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。
该技术以Cre/LoxP系统为基础，Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。
基因敲除
二、基因敲除的方法
利用随机插入突变进行基因敲除。 特点：依赖于细胞内自然发生的同源染色体 的随机交换，但在体细胞内，基因同源重组 利用同源 大规模的随机插入突变理论上可实现在基因 的效率特别低( 低于 10－ 6) 。增加了实际操 重组 作的工作量，限制了该项技术的应用 组范围内敲除任一基因目。 传统基因 敲除方法 该基因敲除( gene knock －out) 技术，是在转染 细胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因 之间的 DNA 同源重组，能够使外源基因定点 地整合到核基因组的特定位置上，从而达到改 应用随机 特点：可以分为 T-DNA 插入突变和转座子插 变细胞遗传特性的目的。 插入突变 入突变，两者是在植物中使用广泛的基因敲 除手段
二、基因敲除的方法
CRISPER/Cas系统的由来：
CRISPR（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats） 广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，是细菌和古细菌的一种适应性免疫系统， 该系统可以介导外源 DNA 的降解，从而抵御病毒等外来入侵者。 1987年日本学者首次在大肠杆菌中发现该间隔重复序列。 2002年，Jansen 等将其正式命名为 CRISPR，基因编码的蛋白质统称为 CRISPR 附属蛋白（CRISPR-association proteins，Cas）。
CRISPR/Cas系统的分类：
TypeⅠ TypeⅡ TypeⅢ三种不同类型 TypeⅡ系统的主要特征是包含一个标志性的Cas9蛋白(分子质 量很大的多功能蛋白)参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌 体DNA或是外源质粒。
CRISPR/Cas的基因座结构
5'端为tracrRNA基因
基因敲除技术研究进展
基因敲除的细胞基础——胚胎干细胞：胚胎干细胞(Eｍbryｏonic胞系,体外培养时保持了未分化状态,可以传代增值,在发育上类似于动物早起胚胎的内细胞团细胞,具有与早期胚胎细胞相似的分化潜能和正常整倍体核型两大特点，是研究哺乳动物个体发育、胚胎分化以及性状遗传机制的理想模型。ＥSC是进行基因敲除研究不可替代的材料。目前，虽然体外培养乳腺细胞、胎儿成纤维细胞等细胞类型的技术都已相当成熟，对这些类型的细胞进行基因组修饰也是完全可能的，但ＥＳC的另一特性是其他任何类型的细胞都不具备的,那就是当将一定数目的ESC注入囊胚期小鼠的囊胚腔后这些细胞就可以参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成,在此基础上，通过检测和选配,筛选出基因组中正常基因被破坏的动物个体,通过行为观察、生理生化指标检测等手段可以揭示该基因的作用。
１. 基因敲除技术简介
基因敲除（Gｅnｅ knｏckoｕｔ)是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列,改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响,进而推测出该基因的生物学功能。
它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。基因敲除借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法,通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏,使特定基因失活,以研究该基因的功能;或者通过外源基因来替换宿主基因组中相应部分,以便测定它们是否具有相同的功能,或将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。基因敲除是揭示基因功能最直接的手段之一。通常意义上的基因敲除主要是应用DＮＡ同源重组原理,用设计的同源片段替代靶基因片段(即基因打靶),从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展,除了基因打靶技术外,近年来新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有ＲNA干扰技术,同样也可以达到基因敲除的目的。简单的说基因敲除是指将目标基因从基因组中删除。基因敲除技术主要应用于动物模型的建立,而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、可靠,它的发展将为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究、治疗手段，具有广泛的应用前景和商业价值。
基因敲除和敲入技术的发展和应用
基因敲除和敲入技术的发展和应用随着科技的不断进步，人类对于基因的探究也日渐深入。
基因敲除和敲入技术作为其中的重要探究手段，则受到越来越多的关注和应用。
本文将从技术原理、研究进展、应用前景等方面阐述基因敲除和敲入技术。
一、技术原理基因敲除和敲入技术是利用DNA重组技术将人造的基因片段有选择地插入到细胞或某个生物体的特定位置，从而改变这个生物体的某种性状或者产生新的性状。
所谓基因敲除，就是将某个基因的序列刻意人为删除；而基因敲入，则是将人造基因片段有选择地插入到细胞或生物体中。
这两种技术都属于基因工程领域内的基础技术，也为其他生命科学领域提供了良好的研究工具。
二、研究进展基因敲除和敲入技术的研究始于20世纪80年代，最早是借助于整合子（Transposon）等修饰体来达到基因敲入的目的。
然而其限制因素太多，因此研究人员开始寻找其他方法。
1996年，Nobuyoshi Shimizu和John Witthuhn在细菌中利用锂盐法将基因敲除策略应用到实践中，为基因敲除技术的研发打下了基础。
此后的20多年里，随着不断的技术进步和生物技术产业的蓬勃发展，基因敲除和敲入技术也得到了飞速发展。
最近几年，基因敲除和敲入技术的进步尤其引人注目。
CRISPR-Cas9技术以其高效易用和精确性受到广泛关注，成为现在最主流的基因敲除和敲入技术之一。
除此之外，ZFN（zinc finger nuclease）和TALEN（TAL effector nuclease）等技术也在持续发展中，不断完善。
随着技术的不断创新和完善，基因敲除和敲入技术的应用范围也越来越广泛。
三、应用前景基因敲除和敲入技术得到广泛应用的趋势也日益明显，涵盖了从基础科学到临床医学的多个应用领域。
在基础科学领域，基因敲除和敲入技术可以被广泛应用于基础遗传学、生理学、细胞生物学、分子生物学等各个领域的研究。
以生物缺陷基因的研究为例，利用这两种技术可以实现对缺陷基因的破坏或修复，有助于进一步认识缺陷基因对生命活动的影响机制等。
基因敲除技术的发展和应用
基因敲除技术的发展和应用基因敲除技术是一种将特定基因从生物体中去除的方法，它是现代生命科学领域中一项重要的技术成果。
通过基因敲除技术，科学家们可以研究某一特定基因对生物体的影响，从而探究其在生命活动中的作用和功能。
近年来，随着技术的不断发展和完善，基因敲除技术已经被广泛应用于医学研究、药物研发、农业生产等多个领域。
一、基因敲除技术的原理及方法基因敲除技术首先要求找到一个目标基因，并使用特定的方法将目标基因从生物体中去除。
常用的基因敲除方法包括：1. CRISPR/Cas9技术CRISPR/Cas9技术是一种先进的基因编辑技术，其原理是结合基因组的特定地点的DNA序列和Cas9蛋白，同时在该位置展开双链切割，以实现基因敲除。
此方法常用于动物实验中，对于细胞实验和基因组编辑具有广泛应用。
2. RNA干扰（RNAi）技术RNA干扰技术是通过合成特定的RNA分子干扰目标基因的正常功能，从而实现基因敲除。
在这种技术中，合成小的RNA分子，称为siRNA，它能够靶向那些启动转录的基因，使这个基因不再表达。
RNAi技术被广泛用于细胞实验，并被视为一种潜在的治疗癌症的技术。
3. Zinc Fingers（ZF）技术锌指蛋白技术是一种利用锌指蛋白靶向DNA序列来实现基因敲除的方法。
锌指蛋白是一种能够结合到DNA特定序列的蛋白质，可用于将DNA 分子切断或将其连接到其他DNA 分子上。
通过上述基因敲除方法，科学家们可以有效地去除目标基因，进而探究该基因在生物体活动中的作用和功能。
二、基因敲除技术在医学研究中的应用基因敲除技术在医学研究中的应用十分广泛。
通过基因敲除技术，科学家们可以研究某一特定基因的功能，以探讨其与某些疾病的关系。
例如，最近的一项研究发现，敲除一个名为Hif1a的基因可以减轻肺纤维化的症状，这为开发新型治疗药物提供了有力的理论基础。
此外，基因敲除技术还被用于肉毒杆菌抗毒素的研究中。
肉毒杆菌是一种由细菌产生的有毒物质，可以严重破坏人体神经系统。
基因敲除技术研究进展及其应用
目录
01 一、基因敲除技术的 基本原理和历史发展
02
二、基因敲除技术的 最新研究进展
03
三、基因敲除技术的 应用实例
04 四、未来展望
05 参考内容
基因敲除技术是一种重要的分子生物学研究工具，它通过删除或灭活特定基 因，研究基因功能以及其对细胞生命活动的影响。近年来，随着基因敲除技术的 不断发展和优化，其在医学、生物学等领域的应用也越来越广泛。本次演示将介 绍基因敲除技术
在工业领域，基因敲除技术主要应用于微生物工程、生物制药等领域。利用 基因敲除技术，科学家们可以改造微生物和菌种，提高微生物的工业发酵效率和 产率，为生物制药和化工生产等领域提供有效手段。
近年来，基因敲除技术的研究进展迅速，新的技术和应用不断涌现。例如， 通过结合基因编辑技术，科学家们可以实现对特定基因的精细调控，从而达到更 高的目标基因敲除效率；此外，利用基因敲除技术，科学家们还成功培育出多种 新型生物材料和工业菌种，为相关领域的发展带来了新的突破。
四、未来展望
随着基因敲除技术的不断发展和优化，未来其在医学、农业、生物学等领域 的应用前景将更加广阔。但同时也面临着一些挑战和问题。首先，如何提高基因 敲除技术的准确性和效率仍然是需要解决的重大问题。其次，如何将基因敲除技 术应用到更多的
生物物种和细胞类型中也是一个具有挑战性的问题。此外，如何在确保有效 性的同时降低基因敲除技术的成本和风险也是一个需要和研究的问题。
1、优点
基因敲除技术具有许多优点。首先，它是一种精确的基因编辑手段，可以准 确地在特定位置敲除或替换基因。其次，基因敲除技术可以用于研究基因的功能 及其对细胞生命活动的影响，有助于深入了解生命的本质和规律。此外，基因敲 除技术还可以用
基因敲除的技术和应用
基因敲除的技术和应用随着现代生命科学技术的发展，人们逐渐感受到基因敲除技术的强大和对于生命科学研究的深刻影响。
基因敲除是一种迅速且精准的基因表达抑制技术，其引起的基因失活可以为许多生物学问题提供重要答案。
本文将介绍基因敲除技术的原理及其应用。
基因敲除技术的原理基因敲除（Gene Knockout）是通过基因转染、体外转录、酶联反应以及基因编辑等手段，将物种基因组DNA序列的一部分或全部突变或删去，以制造失活变异体，实现基因靶点的消除，从而破坏目标基因的功能。
这种技术需要在实验室内精准选择目标基因（受体、信号通路等）并引入外源DNA分子，以制造一定的突变或完全失活的生理状态。
国际上常用的基因敲除系统有Cre-LoxP系统、Flippase （Flp）/FRT系统、Tet-On/Tet-Off系统、RNAi系统等。
Cre-LoxP系统是基于一个菌群住在肠道内的细菌切割酶的作用。
LoxP位点为34个碱基的DNA序列，Cre为双链酶，可以识别该位点，同时发挥切割酶和粘接酶的作用，形成“切掉”或“加入”等效果，从而达到改变目标基因DNA序列的目的，进而实现基因敲除的作用。
而Flippase（Flp）/FRT系统则是以酵母菌的响应元件FRT为基础。
在这个系统中，与Cre-LoxP系统类似的重新组合酶Flp可以切割、粘接两个FRT位点，使相邻的基因模块（例如启动子和融合基因）被分离，实现目标基因失活。
Tet-On/Tet-Off系统则是利用反转录病毒的基因表达特性，通过快速手段改变靶向基因表达。
该系统中，编码反向反而使靶向基因表达迅速发生变化，在短时间内实现基因敲除，并进一步研究变化造成的生物学效应。
RNAi系统则是通过RNA 干扰技术实现目标基因敲除。
其中，siRNA技术主要包括设计合适的RNA序列，然后将其导入到靶向基因的mRNA中，促成靶向基因的特定片段丧失其生物学功能，达到敲除目标基因的目的。
基因敲除技术的应用基因敲除技术主要应用于以下两个方面：1.生命科学研究基因敲除技术在生物医学、基础研究和农业等领域的应用非常广泛。
基因敲除技术研究的新进展
基因敲除技术研究的新进展随着科学技术的不断进步，基因敲除技术已经成为了生命科学领域的一个热门话题。
基因敲除技术，顾名思义，就是通过人工手段将某个指定的基因进行删除或者失活，以此来观察该基因对生命体的影响。
这一技术不仅广泛应用于疾病的治疗和药物研发领域，也被广泛应用于基础生命科学研究中。
近年来，国内外的科研人员在基因敲除技术方面取得了新的进展，下面我们一起来看看。
一、CRISPR-Cas9系统CRISPR-Cas9系统是一种现代基因敲除技术，其工作原理是利用一种名为“CRISPR间隔性重复序列”的DNA片段，与另外一种名为Cas9的蛋白质相结合，来精确地定位到目标基因，然后通过激活Cas9蛋白质的“剪刀”能力，将目标基因直接切除或者重组。
这种技术具有操作简便、易实现、高效率等优点，在分子生物学和遗传学研究中得到了广泛的应用。
近年来，国内外的科研人员在CRISPR-Cas9 系统的研究中也取得了新的进展。
例如，来自美国约翰霍普金斯大学的科研团队最近成功利用CRISPR-Cas9技术创造了一种人类内源性类似痴呆样病变的小鼠模型，研究这种小鼠怎样即使在非遗传亲缘关系中，也能产生类似于人类的认知衰退。
此外，来自中国科学院上海药物研究所的科研团队也在使用CRISPR-Cas9技术发现了一个叫做EID1的基因对肝功能有着重要影响的结论。
这些研究的结果为基础生命学研究和疾病治疗提供了有力的支持。
二、基于RNAi的基因敲除技术与CRISPR-Cas9等现代基因敲除技术不同，基于RNAi（RNA干扰）的基因敲除技术是将人工设计的小分子RNA与RNAi复合物结合，以直接干扰基因的表达，实现基因敲除的目的。
由于RNAi技术具有更低的毒性和更高的精度，使之成为生命科学界更为常用的基因敲除工具之一。
近年来，国内外的科研人员也在这一领域取得了诸多突破。
例如，来自英国戴维斯大学医学中心的科研团队最近成功利用RNAi技术干扰一种叫做PGC-1α的基因，这个基因是一种重要的调节因子，对于身体脂肪代谢、葡萄糖调节、线粒体功能和氧化应激恢复等的调节有着至关重要的作用。
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基因敲除技术研究进展及其在代谢工程上的应用The Current Status of Gene Knockout and its Application in MetabolicEngineering天津大学化工学院二零壹六年六月摘要基因敲除技术是20世纪80年代发展起来一项重要的分子生物学技术，在微生物代谢工程，动植物改造以及功能基因研究方面具有广泛的应用。
本文介绍了基因敲除的策略和在代谢工程中的作用，着重介绍了四种新兴的基因敲除策略：RNAi，ZFN，TALENs以及最近研究火热的CRISPR/Cas9。
并在最后展望了基因敲除技术尤其是新兴技术在相关领域的发展趋势，为基因敲除技术的进一步发展提供了参考。
关键词：基因敲除代谢工程同源重组CRISPR/Cas9ABSTRACTGene Knockout is an important molecular biotechnology which has developed sine 1980. It has been proved efficient in microbial metabolic engineering, transform of nimals and plants and functional genomics. In this review, we mainly introduced the strategies of gene knockout and its application in metabolic engineering.And four new strategies RNAi, ZFN, TALENs and CRISPR/Cas9 were highlighted in detail. At last, developing frontiers and application prospects of gene knockout were further discussed.KEY WORDS：gene knockout, metabolic engineering, homologous recombination, CRISPR/Cas9目录第一章基因敲除技术 (1)1.1基因敲除相关背景 (1)1.2基因敲除技术在代谢工程中的应用 (2)第二章基因敲除策略 (3)2.1传统的基因敲除策略 (3)2.1.1利用同源重组进行基因敲除 (3)2.1.2利用随机插入突变进行基因敲除 (4)2.2新兴的基因敲除策略 (5)2.2.1 利用RNA干扰引起的基因敲除 (5)2.2.2 锌指核酸酶基因打靶技术 (5)2.2.3 TALENs 靶向基因敲除技术 (6)2.2.4 CRISPR/CAS9基因敲除技术 (7)第三章前景展望 (9)参考文献 (10)致谢 (11)第一章基因敲除技术1.1基因敲除相关背景随着测序技术的迅速发展，生物体基因功能的研究已经成为当下最热门的课题。
现阶段基因功能的研究主要是通过减弱或中止某一基因表达，观察生物体整体功能变化，推测该基因的相关功能，然后将基因与生物整体功能相关联进行深入探究，为最终确定基因功能提供依据[1]。
随着功能基因组学研究的深入，相关技术也得到不断地发展与完善，其中最为常用的便是基因敲除技术。
基因敲除是20世纪80年代末发展起来的一门新技术，2007年获得诺贝尔生理或医学奖[1]。
该技术是以DNA同源重组技术和胚胎干细胞技术为基础，经过30余年的发展，现今已经有多种基因敲除技术被应用于分子生物学、遗传学等诸多领域[2]。
而近年来新兴起了ZFNs、TALENS、Cas9等多种基因高效靶向修饰和调控技术。
2012年1月基因组编辑核酸酶技术的Nature Methods杂志评选为年度研究方法[3]。
2012年12月被Science杂志评为2012年度十大科学进展之一[4]。
这些技术极大地提高了基因敲除的效率，且具有极高的特异性，为研究基因功能创造了新的途径必将极大地推动生物学、医学研究的发展。
基因敲除技术分为完全基因敲除和条件型基因敲除。
完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性。
条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除[5]。
现阶段条件型基因敲除以噬菌体的Cre/Loxp系统和酿酒质粒的FLP/FRT系统应用最为广泛。
基因敲除技术已从最初简单的完全敲除发展到条件敲除阶段，现正朝着特定组织基因敲除、特定时间基因敲除的可调控敲除方向发展。
然而，基因敲除也有其无法克服的缺点和不足：1）在敲除过程中，被破坏的常常只是靶基因的部分外显子而并不是整个编码区，残留的编码序列有可能组合出新的未知的功能，这将给表型分析带来麻烦；2）敲除掉某个基因并不一定就能获知该基因的功能，其原因在于许多基因在功能上是冗余的，敲除掉一个在功能上冗余的基因，并不能造成容易识别的表型，因为基因家族的其它成员可以提供同样的功能；3）对于某些必需基因，敲除后会造成细胞死亡，也就无法研究这些必需基因的功能；4）实验费用偏高，同一个打靶载体在不同遗传背景下进行基因敲除，获得的表型差异很大[6]。
1.2基因敲除技术在代谢工程中的应用具体而言，代谢工程是利用基因工程技术或其他物理、化学方法对细胞的代谢途径进行精确地修饰与改造，对细胞内目标物质的代谢流进行扩展、减小、阻断或构建新的代谢途径，从而有目的、有理性地改变微生物原有代谢特性，改进或者构建新的微生物表型，并与微生物基因调控、代谢调控及生化工程相结合，提高目的代谢产物活性或产量、或合成新的代谢产物的工程技术科学[7]。
代谢工程的难题就是如何使微生物的代谢主流流经理想载流途径。
在发酵生产中, 为了达到这一目的，从营养物质进入细胞到产物产生通常需要从三个方面加以控制[8]，即：a. 使来自上游和各个注入分支的碳架物质能畅通地流向目的产物；b. 阻塞或去除与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产物；c. 消除或削弱目的产物进一步代谢的途径。
在上述各过程中，起关键作用的无疑是酶，而基因敲除技术的出现使快速失活成为现实，从而达到调节代谢流，优化代谢途径的目的。
通过基因敲除技术，可研究被敲除基因的生物学功能，还可以进行功能基因的插入及染色体基因的替换，进而可以阻断微生物细胞的代谢旁路，减弱毒/副作用，强化目标产物的产量或质量，降低能耗，从而成为具有重要工业应用价值的微生物细胞工厂研究中的重要内容[9]。
第二章基因敲除策略以下本文将通过两个方面讲述基因敲除技术，一是传统的基因敲除策略；二是新兴的基因敲除策略。
并对这些策略做一些简单介绍以及概括。
2.1传统的基因敲除策略2.1.1利用同源重组进行基因敲除经典的基因敲除策略是利用上述同源重组基本原理，通过体外改造一定长度/形式的基因，与细胞染色体上的靶基因发生同源重组(插入或置换)，从而改变细胞的遗传特性。
从同源重组的基本原理出发，分别针对同源重组的底物类型(单链/双链、线性/环状)、重要蛋白(RecA 酶、RecBCD 酶等及噬菌体中具有相似功能的酶) 和功能位点(Chi 位点) 等进行分子设计，即可开发出各种不同的基因敲除方法，根据同源重组载体的不同，可以把基因敲除方法分为线性单链DNA (ssDNA)、线性双链DNA(dsDNA) 以及环状双链DNA (质粒载体) 等3类：1.线性单链DNA 敲除策略不但打靶载体易于构建，且其重组效率是双链DNA的10~100倍[10]；2.采用线性双链DNA进行同源重组，是近年来基因敲除方法的热点之一。
其优点是可以避免较为繁琐的基因克隆和质粒载体构建步骤，而直接采用PCR方法扩增获得目标同源重组片段。
然而，线性双链DNA 易于被细胞内的RecBCD 酶降解，为了解决上述问题，可以在线性双链DNA 的两侧引入Chi位点，保护DNA不被RecBCD 酶降解，并能强化RecBCD 酶介导的同源重组效率[11]。
3.构建环状质粒载体进行目标基因敲除的方法，是实现微生物基因敲除的经典策略，主要通过微生物本身的RecA 重组系统( 主要包括RecA 和RecBCD 等蛋白) 发挥作用。
RecA 蛋白是单链结合蛋白，促进各类DNA 分子间的同源联会、配对、链交换和分支迁移RecBCD 是由RecB、RecC 和RecD三个蛋白组成的复合体，它能与双链切口结合使DNA 链解开，并在Chi位点形成单链，然后由RecA蛋白促进同源重组。
由于RecBCD 具有核酸外切酶V的活性，所以线性DNA分子在细菌体内会被降解。
因此，必须通过环状质粒载体克隆来完成同源重组片段的分子设计和构建[9]。
常用的环状质粒载体敲除策略有4种[12]：a.非复制型质粒载体敲除法对野生菌做基因敲除，可以先考虑用非复制型载体。
由于构建好的敲除载体在受体菌中是不复制的，因此转化之后，在选择压力下，未发生重组的转化子由于敲除载体不能复制随着菌体生长而被稀释。
b.不稳定型质粒载体敲除法若受体菌感受态较难制备，可考虑采用不稳定型敲除载体。
这种质粒在受体菌中分配不稳定,在无压力选择或低磷条件下培养5～10代会出现很多质粒丢失的细胞。
因此转化后可先控制培养条件使敲除载体随细胞复制以增加转化子的数目，然后再在无压力选择或低磷条件下让质粒丢失，最后在选择压力下筛选敲除子。
c.温度敏感型( Ts型) 质粒载体敲除法1993年，Biswas等[13]利用Ts型质粒建立了革兰氏阳性菌高效的基因敲除系统。
Biswas所用质粒pG+host5在37℃时不复制，而28℃时以滚环模式进行复制。
因此转化后在选择压力下37℃培养会导致第一次同源重组sco(single-crossover)，之后将温度降至28℃，会促使质粒发生滚环复制，这种复制机制会导致发生第二次dco(double-cross-over)。
重组后，目的基因或是被敲除，或是回复成野生型。
d.结合转化敲除法如果要进行基因敲除的目标菌不易制备感受态或感受态效率很低，则可以通过寻找“中介菌”来完成基因转移的过程。
2.1.2利用随机插入突变进行基因敲除大规模的随机插入突变理论上可实现在基因组范围内敲除任一基因。
这项技术具有效率高、基因完全失活以及容易分离鉴定等优点。
目前较为有效的方法是随机插入突变可以分为T-DNA插入突变和转座子插入突变，两者是在植物中使用广泛的基因敲除手段：A．T-DNA插入失活技术是利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将一段带有报告基因的DNA序列标签整合到基因组DNA上。
可以直接在植物基因组DNA 中产生稳定的插入突变，而且插人位点的随机性较强，但是只适用于那些容易被T-DNA转化的植物，且常常会引起染色体重排现象，使突变体表型与T-DNA插入无关而难以进行遗传学分析。