原代细胞培养步骤

原代培养(primary culture)，准备工作：

A玻璃用品清洁，灭局步骤：

1，洗涤剂正常洗刷干净

2，放入托盘中，200度烤1-2h（烘干）

3，泡酸（过夜），吸管捆好，做好记录

4，捞酸，冲洗干净（注意安全）

5，放入托盘中，200度烤1-2h（烘干）

6，包瓶，吸管用棉花塞好，报纸包好，烧杯和配液的瓶子，瓶口内层用硫酸纸，外层用牛皮纸，包好，用线系好

7，放入托盘中，200度烤2h（灭菌）

8，收集放好

B塑料，瓶盖，胶塞清洁处理步骤

1，用洗涤剂正常刷洗干净

2，晾干，放入酸中，过夜（胶塞除外）

3，次日捞出，冲洗干净，过三水（蒸馏水，三蒸水，去离子水）

4，放入饭盒中，高压锅，烘干箱，烘干

C器械盒（3把剪刀，2把镊子，2个烧杯，2个滤网，2个培养皿）

1，洗涤剂冲洗干净

2，过三水

3，放入饭盒中压，烘干

乳鼠心肌原代培养过程：

A准备工作：

1，剪封口膜（3-4个长的；鼠的只数x2+2的短封口膜）

2，器械：平镊，弯镊，剪刀（3把），筛网

3，离心管，吸管，平皿1对，50ml烧杯1个，冰袋

4，DMEM，DMEM+10%FBS 胰酶（不含EDTA—除去细胞互相粘着所依赖的Ca2+，再经机械轻度振荡，使之成为单细胞。）

B步骤

（一）准备

1，将所需的离心管放在试管架上(PS：大概一只心脏一只离心管；多准备3个--2个消化细胞用，一个放混匀用的吸管用)

2，点燃酒精灯，依次将吸管打开，加上胶头，并标明吸何种液体，以免操作中混淆（PS：2个吸管--胰酶和混匀用；一个移液管--移取培养液用）

3，打开试剂，将其盖，放在远离操作的空间尽量往里

4，打开器械，按顺序依次摆放（2把剪刀；一把弯镊）

5，用酒精擦试冰袋，打开平皿，并将平皿过火，将平皿放在冰袋上，在每个平皿里加入DMEM(无血清)

（二）取乳鼠心脏

1，戴无菌手套，将小鼠浸入酒精中消毒，捏抓小鼠背部皮肤，用1st剪刀剪掉头部，然后剪开皮肤，在用2nd剪刀，剪开胸骨（靠左侧点）用镊子夹取心脏，放入DMEM平皿中，注意镊子不要碰到别处。（PS：剪时不要剪到腹腔，避免污染）

2，待所有乳鼠心脏取完后（将心脏上带的血管和心房剪掉）

3，将剩下的心室剪成均匀的几块（*均匀）

（三）消化

1，用吸管，将均匀几等分的心脏，吸入离心管中，将上清DMEM弃掉，加入大约组织块2倍的胰酶，进行消化，封口，放入37度水浴锅中摇晃，大约3分钟，用吸管将胰酶吸出弃掉。（清洗组织）

2，重新加入新的胰酶，封口，放入37度水浴锅中摇晃，大约1分钟，timer计时（具体时间可以依胰酶活性再摸索），待液体浑浊时（液体不要变黄-消化过了；白色范围内即可），将液体吸出，放入另一个离心管中加入等体积的DMEM+FBS以中和胰酶，注意混匀，封口，放入4度，而原有组织块的离心管，再加入2倍的胰酶。

3，重复，操作“2”6-7次，直至组织块消化完。

4，消化液在不锈钢筛网上过滤，之后再将烧杯中的液体加入新的离心管中，封好，2500r/3min （1500r/5min）离心。（PS：离心后，不要震动将沉淀震开）

5，离心后，迅速倒掉上清，向离心管中加入培养液（90%DMEM+10%FBS）

6，轻摇吹匀，吸入培养瓶中，瓶口旋松，倒置，放入CO2培养孵箱中（PS：3只鼠一只培养瓶；每个培养瓶4ml培养液；一只鼠一个小皿；每个小皿1-2ml培养液）

7，差速贴壁：

（1）在1.5-2h后，将倒置的瓶正着取出，用10-100uL枪以100:1的比例加入双抗和BRDU （抗成纤维生长），放入CO2孵箱中培养（正方）

（2）48小时心肌细胞贴壁，换液（有血清DMEM，注用PBS清洗细胞表面，不要将贴壁细胞吹起）

注：原代细胞培养后，48小时换液

第二天早上，培养，换液后的细胞状态良好才可以用

转染，转染试剂+mi-RNA，混合15-20min

转染试剂用量：瓶+10ul；6孔+5ul

转染6h后换液；转染换液后24h后可以用。

转染注意事项：

1，有n个孔，摆2n个EP管，分别加入1/2量opti+转染试剂和1/2 opti+mi-RNA

2，X-treme在5min内要将2者混起来，lipo是5min以上；混合20min左右，则可加入细胞中。

3，加入时，将培养液弄起，缓慢加入培养液内，不要碰到细胞转染时的比例：

瓶：4000ul培养液（无血清）+1000ul opti(10ul X-treme+490ul opti；10ul mi-RNA+490ul opti) 6孔板：1600ul培养液（无血清）+200ul opti(5ul X-treme+95ul opti；5ul mi-RNA+95ul opti) 24孔板：900ul培养液（无血清）+100ul opti(1ul X-treme+49ul opti；1ul mi-RNA+49ul opti) PS：转染是将外源基因导入细胞内的一种专门技术。