鹿主要传染病的研究进展

BCG对 照组
BVDV对 照组
生理盐 水对照
组
BVDV-E2基因重组卡介苗的构建
0.6
0.5
0.4 pMV361-E2重组卡介苗
pMV261-E2重组卡介苗
0.3
pMV361空载体卡介苗
pMV361空载体卡介苗
BCG对照组
0.2
BVDV对照组
生理盐水对照组
0.1
0 0
7 14 21 28 35 42
如PCR技术， 核酸探针技术
细
菌
1.细菌学检测方法
分
离
8 7 6 5 4 3 2 1 0
123456789
三维柱形图 1
1.牛分枝杆菌 2.鸟－胞内分枝杆菌 3.偶发分枝杆菌 4.堪萨斯分枝杆菌 5.戈氏分枝杆菌 6.苏尔加分枝杆菌 7.无色分枝杆菌 8.瘰疬分枝杆菌 9.未能定型
2.免疫学检测方法
0.14
0.13
0.12
0.11
0.12
0.12
阴性血清阻断组
0.14
0.13
0.13
0.12
0.12
0.11
间接ELISA实验敏感性实验结果
OD值
1﹕100 0.46
1﹕200 0.44
1﹕400 0.41
血清稀释度
1﹕800 0.31
1﹕1600 0.25
1﹕3200 0.18
1﹕6400 0.13
E2基因不同片段的PCR扩 增产物
E2不同片段重组pMV261 质粒双酶切鉴定
BVDV-E2基因的优化表达
E2不同片段重组pMV261 质粒PCR鉴定
重组质粒在卡介苗中的表达
敏感药物筛选的研究
药物抗BVDV抑制率(%)
鹿口蹄疫病
• 概述 • 流行情况 • 分离鉴定 • 诊断方法 • VP1基因的原核表达
吉林 黑龙江
山东 宁夏 甘肃 陕西 四川 青海 安徽 江苏 广西
0.00%
10.00%
20.00%
30.00%
鹿
40.00%
牛
50.00%
73.60%
49.29% 62.50%
73.35%
27.41%
59.60%
55.95%
41.48%
40.60%
38.46%
28%
24.70% 24.71% 10.00%
1. 免疫用疫苗 口蹄疫O型、亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗。 2. 免疫对象 成年、育成、90日龄以上的公、母鹿均可。 3. 免疫用法与用量 3.1所有鹿首免时均采用二次免疫法，即第一次免疫后 20～30天再免疫一次。 3.2免疫途径为颈部或臂部肌肉注射。 3.3免疫用量 成年和育成鹿2ml/每头，90日龄以下仔鹿 1ml/每头。 6.免疫期 免疫保护期6个月。
100 10-5.1 10-5.2
12 3
4
1631bp
517bp 396bp 344bp 298bp 221bp
RT-PCR扩增产物琼脂凝胶电泳
1.为正常细胞对照 2.为长春184株 3.为N71株 4. 为PBR 322 DNA/Hinf I Maker
BVDV血清学诊断
BVDV血清学诊断 双抗体夹心法检测BVDV抗原
概述
口蹄疫病毒（FMDV）
口蹄疫病毒电镜图片
口蹄疫病毒核衣壳结构
口蹄疫病毒基因组结构图
概述
• 流行情况
分离鉴定
FMDV分离鉴定
分离株接毒24h的细胞病变
分离株接毒48h的细胞病变
分离株接毒48h的细胞病变
正常对照细胞
分离鉴定
O型标准血清补反结果
C型标准血清补反结果
A型标准血清补反结果
AsiaⅠ标准血清补反结果
扩增产物：
F1D1－891bp(1-297aa)、F1D2－1035 bp(1-345aa)、 F1D3－1122bp(1-374aa)、F2D1－755 bp(45-297)、 F2D2－899 bp(45-345aa)、 F2D3－986bp（45-375aa） 。
BVDV-E2基因的优化表达
表达BVDV-E2的重组卡介苗
E0基因疫苗免疫试验
BVDV- E0核酸疫苗免疫试验
梅花鹿源BVDV分离株基因苗与灭活苗免疫家兔的 抗体测定的OD值
E0基因疫苗免疫试验
梅花鹿源BVDV分离株基因苗与灭活苗免疫家兔 的抗体OD值统计结果
E0基因疫苗免疫试验
梅花鹿源BVDV分离株基因苗与灭活苗免疫家兔 血清抗体比较趋势图
分离鉴定
RT-PCR扩增结果
1.分离株细胞培养物 2.DNA Marker DL2000
50nm
FMDV 电镜照片
FMDV血清学诊断
间 接 法 检 测 FMDV 抗 体
血清学诊断
间接ELISA特异性阻断实验结果
样品号
1
2
3
4
5
6
未阻断组
0.43
0.45
0.49
0.43
0.47
0.43
阳性血清阻断组
BVDV-E2基因的优化表达
BVDV-E2基因的优化表达
根据E2基因主要抗原位点设计5条引物，通过引物两 两配对实现E2基因的部分扩增。 引物序列：
F1 5-GCC GAATTC CTCCCAGCCTGTAAACCT-3; F2 5-GCC GAATTC GTGTGGTGTAAAGATGGAGAG-3； D1 5-GCG ATCGAT TTAGAAGGTACATGCCGTC-3； D2 5-GCG ATCGAT TTACAGCAGGGACTCAGCCG-3； D3 5-GCG ATCGAT TTAACCTAAGGTCGTTTGTTCTAG-3。
44kD
pMV361-E2重组卡介苗免 疫印迹检测结果
BVDV-E2基因重组卡介苗的构建
动
物
免疫次数：共3次
免疫间隔：两周
实
验
采集血液
分组免疫家兔
组别
间接ELISA （结核和BVD）
T淋巴细胞转 化（MTT）
pMV36
1-E2重 组卡介
苗
pMV26
1-E2重 组卡介
苗
pMV36 pMV36 1空载体 1空载体 卡介苗 卡介苗
温度敏感试验
处理
处理组 对照组 处理组 对照组 处理组 对照组 处理组(pH3.0) 对照组(pH7.2) 处理组(pH9.0) 50℃30分钟 50℃60分钟 50℃70分钟 56℃30分钟 56℃60分钟 56℃70分钟
TCID50/0.1mL
100 10-5.2 100 10-5.0 10-2.0 10-5.2 10-0.8 10-5.2 10-4.8 10-4.6 10-3.5 10-1.5 10-3.2 10-2.3 100
1 2M
97.2 66.4 44.3
M
12
29.0
44KD
20.1
pMV261-E2重组卡介苗免疫印迹检测
14.3
结果
pMV261-E2重组卡介苗SDS-PAGE 结果
BVDV-E2基因的穿梭表达载体的构建及表达
M1 2 44kD
pMV361-E2重组卡介苗 SDS-PAGE结果
97kD 66 kD 44 kD 31 kD 20 kD 14 kD
0.304±0.026c
Ⅳ
0.394±0.036c
0.313±0.037c
Ⅴ
0.407±0.047b
0.308±0.043b
Ⅵ
0.219±0.019a
0.308±0.043b
Ⅶ
0.271±0.022b
0.256±0.026b
Ⅷ
0.284±0.026c
0.331±0.031b
Ⅸ
0.278±0.029c
重组卡介苗组与对照组免疫家兔结核病抗体比较趋势图
BVDV-E2基因重组卡介苗的构建
0.35
0.3
0.25
pMV361-E2重组卡介苗
pMV261-E2重组卡介苗
0.2
pMV361空载体卡介苗
pMV361空载体卡介苗
0.15
BCG对照组
0.1
BVDV对照组 生理盐水对照组
0.05
0
重组卡介苗免疫家兔后淋巴细胞在E2蛋白刺激后增殖情况
0.260±0.028c
Ⅹ
0.184±0.013a
0.162±0.017a
PHA、LPS刺激前的淋巴细胞 PHA、LPS刺激后的淋巴细胞
BVDV-E2基因重组卡介苗的构建
pMV361-E2
rBCG
BCG BVD
E2
BVDV
BVDV-E2基因重组卡介苗的构建
重组卡介苗菌落图
BVDV-E2基因的穿梭表达载体的构建及表达
鹿主要传染病的研究进展
杜锐 吉林农业大学中药材学院
汇报内容
1、牛病毒性腹泻黏膜病 2、鹿口蹄疫病 3、鹿结核病 4、鹿布氏杆菌病
牛病毒性腹泻黏膜病
• 临床症状 • 流行情况 • 分离鉴定 • 诊断方法 • 新型疫苗 • 药物筛选
概述
• 临床症状
概述
• 流行情况
牛感染 BVD
鹿感染 BVD
新疆 内蒙古
重组卡介苗组与对照组免疫家兔BVDV血清抗体比较趋势图
BVDV-E2基因重组卡介苗的构建
1.2
1
0.8
pMV361-E2重组卡介苗
pMV261-E2重组卡介苗
pMV361空载体卡介苗
0.6
pMV261空载体卡介苗 BCG对照组
BVDV对照组
生理盐水对照组 0.4
0.2
0 0
7 14 21 28 35 42
FMDV-VP1基因的原核表达
1
2
3
1
2
2000 1000 750 500 250
100
FMDV YT株VP1基因 RT-PCR结果
pGEMT-VP1PCR鉴定
pGEMT-VP1的酶切鉴定
FMDV-VP1基因的原核表达
表达载体pET-28a(+)双酶切
pGEM-VP1质粒双酶切
FMDV-VP1基因的原核表达
鹿结核病
概述 研究进展
概述
1 病原学
病料中分枝杆菌形态
纯培养的分枝杆菌形态
2 症状及病理剖检 畸
形 茸
珍珠样结节
结节坏死
3
流行情况
31%~42%
欧洲 亚洲
北美洲 大洋洲
研究进展
一、 诊 断 方 法
细菌学检验方法 免疫学检测方法
如涂片镜检， 细菌培养
如ELISA法， 皮内变态反应
分子生物学检测方法
E0基因疫苗免疫试验
TB
， 淋 巴 细 胞 转 化 实 验 结 果
鹿BVDV分离株核酸疫苗细胞 免疫检测结果(A570)
组别 Ⅰ Ⅱ
PHA刺激A570值 0.186±0.011a
LPS刺激 A570值 0.168±0.020a
0.414±0.044b
0.289±0.025b
Ⅲ
0.405±0.055b
结核菌素试验 如（OT点眼实验）
酶联免疫吸附试验（ELISA）
实践证明
变态反应检测
+
ELISA检测
可有效提高检测的准确性
即对结核菌素点眼实验阴性者和可疑者进行ELISA 检查，ELISA阳性者判为结核阳性鹿，ELISA阴性者判 为结核阴性鹿（即点眼和ELISA双阴性鹿）。
重组载体pET-28a（+）-VP1 酶切鉴定
重组质粒pET-28a（+）-VP1 PCR鉴定
FMDV-VP1基因的原核表达
pET-28a（+）-VP1的IPTG 诱导浓度优化
pET-28a（+）-VP1的诱导时间优化
FMDV-VP1基因的原核表达
pET-28a（+）-VP1免疫印迹 检测结果
免疫规程：
BVDV分离鉴定
BVDV分离鉴定
N71株接种MDBK细胞的 病变
正常MDBK细胞 对照
BVDV分离鉴定
N71株细胞培养物电镜负染观 察（80,000倍）
N71株与长春184株免疫荧光 交叉试验结果
BVDV分离鉴定
N71毒株TCID50测定结果:10-5.4。 N71毒株理化特性测定结果
检测项目 乙醚敏感试验 氯仿敏感试验 胰蛋白酶敏感试验 酸碱度敏感试验
60.00%
70.00%
80.00%
• 流行情况（柱形图）
概述
研究进展
E0产生的中和抗体能中和BVDV和CSFV，且在这一蛋 白内有一高度保守结构域，因此它可用于研究亚单位疫苗。
E2 的N端既是决定BVDV抗原性的主要部位，也是与抗 BVDV抗体结合、介导免疫中和反应及与宿主细胞识别、 吸附的主要部位。
根据牛病毒性腹泻病毒NADL株的NS2-3基因和E0基因序列， 设计合成了2对BVDV引物，对分离毒株进行RT-PCR鉴定。
NS2-3的RT-PCR鉴定
E0的RT-PCR鉴定来自BVDV Realtime-PCR诊断
BVDV Realtime-PCR诊断
疫苗研究
BVDV基因工程疫苗研究进展
BVDV-E0核酸疫苗
BVDV分离鉴定
N71毒株中和试验结果
项目
MDV阳性血清 MDV阴性血清
对照
处理
TCID50/0.1
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7
mL
0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 4/4 4/4 4/4 4/4 2/4 1/4 0/4 4/4 4/4 4/4 3/4 3/4 1/4 0/4
样品编号
1 2 3 4 5 6
间接ELISA实验重复性实验结果
阳性样品
Ⅰ
Ⅱ
阴性样品
Ⅰ
Ⅱ
0.45
0.44
0.13
0.15
0.43
0.46
0.13
0.14
0.42
0.40
0.14
0.13
0.45
0.45
0.13
0.15
0.42
0.43
0.14
0.13
0.44
0.46
0.14
0.15
FMDV-VP1基因的原核表达
结果判定：凡P/N值大于或等于2.0的样品 为阳性；凡P/N值小于2.0的样品为阴性。
BVDV血清学诊断
间接法检测BVDV抗体
包被已知抗原
与待测抗体孵育
与酶标抗体孵育
加入底物
显色
结果判定：凡P/N值大于或等于2.0的样品 为阳性；凡P/N值小于2.0的样品为阴性。
BVDV RT-PCR诊断
BVDV RT-PCR诊断