结核病实验室检测新诊断技术

基因芯片
将核酸片段有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚 丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集二 维分子排列。 采用光导原位合成或微量点样等方法。
然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交。 通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机
（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测 分析，从而判断样品中靶分子的数量。
实验室方法
试剂分别按2:1和3:1加入未经处理的痰标本 和去污处理的痰标本中。
室温下手工晃动密闭痰盒，15分钟内2次， 然后取2ml灭活后的物质加入检测盒(其内含 相当于0.7ml未处理痰液或0.5ml已去污处理 的痰液)，检测盒放入检测平台。
MTB/RIF检测系统直接输出电子结果。
培阳 涂阳培阳 涂阴培阳 检测一份标本 检测两份标本 检测三份标本 检测HIV合并感染
rpoB基因突变位点：13个位点。 katG基因突变位点：2个位点。 /inhA基因突变位点：2个突变位点。
耐药分子诊断的基本原理
操作较复杂。
特异度与灵敏度不高。
基因芯片耐多药检测试剂已获得欧盟体外 诊断试剂证书（CE-IVD）。
中国药品食品监督管理局的医疗器械证书。
可以作为临床耐药结核病临床诊断和治疗 的依据。
五、结核和利福平耐药的快速分子 鉴定（x-pert）
适用范围：
1、TB复合群鉴定。 2、利福平耐药检测 。 原理：多重PCR扩增和反向杂交来识别。 可以在2小时出报告结果。
实验室方法
痰标本的前处理：同前方法。 试剂加入去污处理的痰标本中。 室温下手工晃动密闭痰盒，15分钟内2次，然
酰半胱氨酸。 痰标本+等体积去污染前处理液：振荡-离心-静
置-PBS清洗-离心-留取沉淀。 二、DNA提取 处理后痰标本沉淀 ： 95°C孵育-超声裂解-取
上清液用于PCR扩增。 三、扩增产物杂交 PCR产物变性，与探针试条上的标记突变位点杂
交，标记物显色。
四、结果判读
试剂质控 位点质控
适用范围：痰涂片镜检 十一五国家重大科技专项：泰兴、江阴 厂家：湖南天骑公司 原理：集菌法
流程图
痰标本消化灭活 基片的夹层杯
离心 细菌附着在基片
在夹层杯中
直接染色 取出基片
于载玻片上
镜检 自动阅片计算机报告系统。
所需仪器设备：普通的抗酸染色液、彭氏杯 （专利）、涂片机、KP21型快速干片机、抗 酸杆菌自动阅片计算机报告系统。
HAIN和目前常规药敏方法比较
比较项目 时间
生物安全级别要求 人员培训
操作简易程度 仪器设备
Hale Waihona Puke Baidu
HAIN 1-2天 较低 2-3天 简单 性价比较高
常规药敏方法 2-3个月
二级实验室 2-3个月 复杂 --
对环境洁净度要求
较高，易出现 假阳性
较高
四、GENECHIP基因芯片耐多药 检测技术
适用范围： 1、TB复合群鉴定。 2、TB菌种鉴定。 3、利福平和异烟肼耐药检测 。 原理：多重PCR扩增和反向杂交来识别。
因、inhA基因）耐药的诊断
所需仪器设备：生安柜、超声振荡仪、PCR扩增 仪、可调温振荡仪
原理：基于分子生物学扩增技术。 rpoB基因突变位点有：4个 Kat基因、inhA基因突变位点有：2个、4个
正确流程
MIX制备
DNA提取
痰液前处理
PCR
杂交
操作步骤
一、痰标本处理 去污染前处理液：氢氧化钠+柠檬酸三钠+N-乙
发光二极管荧光显微镜（LED）
镜下视野
发光二极管荧光显微镜（LED）
不需要加热玻片，步骤简单 视野比普通的显微镜大大2-4倍 • 对数目少的不必使用镜油 • 节省人力时间，时间为普通的1/4每天可检查至少60个涂
片 • 可帮助早期诊断肺结核 – 即使菌浓度较低 • 杆菌也有很高的灵敏度，与ZN相比阳性发现率平均增加
重大专项：泰兴、江阴地区部分实验结果比较
标本及性状
754份痰标本
脓性痰 非脓性痰
即时痰 夜间痰
阳性检出率
液基法
直涂法
23.50%
16.80%
47.50% 13.50% 20.48% 25.6%
40.90% 4.66% 15.06% 17.01%
三、线性探针耐多药检测方法（HAIN）
适用范围： 1、TB的诊断 2、一线抗结核药物耐药诊断 3、二线抗结核药物耐药的诊断 4、目前，利福平（rpoB基因） 、异烟肼（Kat基
检测HIVTB 与HAIN比较 与PCR比较
灵敏度 97.60% 99.80% 90.20% 72.50% 85.10% 90.20% 93.90%
98.40% 无差异
发光二极管荧光显微镜（LED）方法 液基夹层杯技术
线性探针耐多药检测技术（HAIN） 基因芯片耐多药检测技术（GENECHIP） TB和利福平耐药快速分子鉴定（X-Pert）
一、发光二极管荧光显微镜（LED） 方法
适用范围：痰涂片镜检 所需试剂/仪器： LED显微镜、荧光染色液
中盖项目：淮安市（淮阴区、楚州区） 原理：
，
耐药检测基因芯片
基因芯片是基于特定基因位点突变与耐药性的相关性，通 过PCR扩增和核酸杂交技术，检测荧光信号的有无，判断 特定位点的突变情况和细菌耐药性的检测方法。
结核分枝杆菌耐药检测基因芯片基于rpoB/katG/inhA的基 因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核杆菌耐药性 （利福平、异烟肼）。
10%
不需要空调设施 不需要暗室 诊断性能优于标准荧光显微镜 寿命长（~ 15-20,000小时） 荧光染色液有致癌作用，推荐自动染色机。 涂片需避光低温保存。 需加强操作人员的培训和质量控制。
• 成本低廉，价格低于现有的光学显微镜。 适合县、乡级基层实验室使用。
二、液基夹层杯技术
后取2ml灭活后的物质加入检测盒(其内含相 当于0.7ml未处理痰液或0.5ml已去污处理的痰 液)，检测盒放入检测平台。 MTB/RIF检测系统直接输出电子结果。
实验室方法
阳性培养物经MPT64抗原检测以确定其是否属于 结核分枝杆菌菌属。
L-J培养基比例法药敏 /MIGT 快速药敏法。 常规的DNA核酸扩增 hain方法检测耐药