基因工程期末复习整理

动物基因工程

名词解释：

1、体细胞克隆：以体细胞(包括动物成体体细胞、胎儿成纤维细胞等) 为受体，将目的基因以DNA 转染的方式导入能进行传代培养的动物体细胞，再以这些体细胞为核供体，进行动物克隆。

2、显微注射：：在显微操作仪下，将DNA用微吸管注射到处于原核时期受精卵的原核中，外源基因在受精卵繁殖过程中通过DNA复制而整合到基因组，然后将转化后的胚胎移植到受体子宫中继续发育，得到转基因动物。

3、ES细胞：

4、基因打靶：是指外源DNA通过与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组, 整合到预定位点, 从而改变细胞遗传特性的方法。

5、基因敲除：将一个结构已知但功能不祥的基因去除，从DNA水平上设计实验，彻底破坏该基因的功能或消除表达机制，从而推测该基因的生物学功能。

6、乳腺生物反应器：通过转基因技术将外源基因在动物乳腺中高效表达，在乳汁中生产目的产品。

问题：

1、常用动物转基因的方法有哪些？比较优缺点

显微注射法、逆转录病毒法、胚胎干细胞法、基因打靶法、精子载体法体、细胞核移植法、磷酸钙共沉淀法。其中，常用动物转基因的方法有显微注射法、逆转录病毒法、胚胎干细胞介导法。

（1）显微注射法的优点：操作技术性很强

显微注射法的缺点：设备昂贵，胚胎死亡率高

（2）逆转录病毒法的优点：操作简便，可大量感染细胞，形成单拷贝，转化率高逆转录病毒法的缺点：没有包装蛋白，不能形成完整的病毒颗粒

2、谈谈如何获得转基因小鼠？

显微注射法：书118页

逆转录病毒法：书123页

胚胎干细胞法：书123页

3、转基因动物有哪些重要的应用？（书138-143页）

（1）研究基因的结构与功能，了解动物生命现象的内在本质

（2）建立多种疾病的动物模型，研究发病机理及治疗方法

（3）改善动物生产性能，提高动物育种效率

（4）作为医用或食用蛋白的生物反应器，可以通过家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉价的人体药用蛋白。

4、比较在细菌、真核细胞和动物个体中表达外源基因的优缺点？

动物：

优点：目的基因在哺乳动物细胞中表达的蛋白与天然蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎相同且能正确组装成多亚基蛋白，哺乳动物细胞能以悬浮培养或在无血清的培养基中达到高密度且培养体积能达到1000L 以上

缺点：A、哺乳动物细胞的表达水平低B、高表达细胞株构建复杂C、细胞大规模培养工艺复杂D、哺乳动物细胞生产的蛋白质类药物的成本较高

第三章基因工程常规技术

一、名词解释

1．klenow fragment：DNA聚合酶被枯草杆菌蛋白酶水解后产生的大片段，具5’ → 3’聚合酶活性和3’ → 5’外切酶活性，是分子生物学中的重要工具。

2．Taq酶：水生栖热菌（Taq）中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶。

3．核酸酶S：来源于米曲霉素（aspergillusoryzas），作用于ssDNA和ssRNA。

4．末端转移酶：terminal transferase，来源于小牛胸腺。是仅存于前淋巴细胞及淋巴样细胞内的一种不同寻常的DNApol，催化dNTP加到DNA分子3’OH末端。

5．碱性磷酸酶（AKP/ALP）：同源二聚体蛋白，分子量为56KDa。每个单体由449个氨基酸组成，同时每个单体均具有一个活性中心。是能够将对应底物去磷酸化的酶，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。包括BAP（细菌碱性磷酶）和CIP（小肠碱性磷酶）。

6．Plasmid：质粒，是细菌染色体外的闭合环状的双链DNA分子，主要有F 质粒（F因子或性质粒）、R质粒（抗药性因子）、Col质粒（大肠杆菌素因子）。

7．表达载体：具有克隆载体的基本元件，还具有转录/翻译所必需的元件的载体。为了有效的转录，必需有强大的启动子和终止子，为了实现翻译，克隆基因必需有合适的SD （RBS）

8．穿梭载体（shuttle vector）：能在两种宿主生物体内复制的载体，可以运载目的基因穿梭往返两种生物之间。

9．MCS：多克隆位点，指质粒上的一段DNA，其上包括一序列限制性内切酶位点，以利于外源DNA的插入。

10．Cosmid：黏粒，柯斯质粒。一种由质粒和噬菌体联合构建的新载体。黏粒的基因组包括以下部分：质粒复制原点、多克隆位点、抗药性基因和λ噬菌体两端的cos位点。

11．YAC：酵母人工染色体。利用酿酒酵母染色体的复制元件构建的载体，克隆能力为200-2000kb。YAC载体含有的着丝粒,端粒和复制起点三种成份可以满足YAC自主复制，染色体在子代细胞间分离及保持染色体稳定的需要。YAC 以环状方式存在，具有大肠杆菌质粒的复制元件和选择标记，以便保存和增殖。

12．脉冲电场凝胶电泳：DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。该方法可分离长至5Mb的DNA分子。

13．RT-PCR：反转录PCR，由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。

14．RACE：cDNA末端的快速扩增。利用PCR技术在已知部分cDNA序列的基础上特异性克隆其5’或3’端缺失序列的方法。

15．差异显示：利用一系列的oligo(dT)引物，逆转录真核生物细胞中全部表达的mRNA，通过PCR扩增的方法，转换成cDNA双链，再利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将有差异的片段分开，筛选出目的基因。

16．Real-time PCR:实时定量荧光PCR，是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

17．基因组文库：从某种生物体中分离出完整的染色体DNA，并且用限制性内切酶消化到所需的平均长度，连于相应的载体，构建而成。

18.cDNA文库（cDNA Library ）：含某种细胞特定时间所有的mRNA经逆转录

产生的cDNA与相应载体（质粒或噬菌体）连接后，得到的重组克隆的总和

19.滴度：病毒悬液的浓度，可用pfu（噬菌斑形成单位）表示。如每微升的

噬菌斑形成单位(pfu/μL)。

20.差减cDNA文库：差减文库也称扣除文库，对存在差异表达的两种材料提

取mRNA (或反转录后合成cDNA)，用大大过量不含目的基因的一方作为驱动子(Driver)与含有目的基因的试验方(Tester)进行杂交，选择性的扣除两部分共同基因杂交形成的复合物，将含有目的基因的未杂交部分收集后，并连接到载体形成文库。

21.Southern blotting：Northern blotting：都为核酸分子杂交技术。：探针与待测核酸序

列之间的杂交。指将核酸转移至固相载体（能吸附核酸的滤膜或滤纸），用探针（酶或同位素等标记的核苷酸片段）去反应，从而实现对核酸进行分析和鉴定的技术。不同的是，Southern 杂交的对象是DNA。另一个是RNA。

22.缺口平移法：有DNaseⅠ，PolⅠ，标记dNTP。

23.原位杂交（in situ hybridization，ISH）：探针直接与细胞或者组织中的核酸进行杂交，

DNA的变性、杂交及检测等都在载玻片上进行，如菌落杂交、噬菌斑杂交、染色体杂交、组织切片原位杂交、整胚原位杂交。如果探针是由荧光底物标记，最后的检测可以通过荧光显微镜进行直观观察，称为荧光原位杂交。

24.FISH（fluorescence in situ hybridization）：荧光原位杂交技术，是将DNA(或RNA)

探针用特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上,再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA 序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析。

25.基因芯片（DNA microarray）：又称DNA 阵列（DNA array)，在玻片、硅片、薄膜

等载体很小的基质表面上有序地、高密度地排列、固定了大量的靶DNA片段或寡核苷酸片段，形成了高密度的DNA微阵列。

二．简答题

1.基因工程发展过程中标志性的事件有哪些？

1)发现DNA连接酶

2)分离限制性内切酶与逆转录酶

3)体外DNA重组技术的建立及基因工程的诞生

4)DNA测序技术

5)Ti质粒作为植物基因工程的载体

6)PCR技术的发明

2.基因工程的基本原理是什么？