实验性肝硬化大鼠细胞因子IL-18、TNF-α、IFN-γ的变化及意义

实验性肝硬化大鼠细胞因子IL-18、TNF-α、IFN-γ的变化及
意义
党双锁;高宁;程延安;边静;王顺达;孙明珠
【摘要】目的探讨在四氯化碳(CCl4) 复合因素诱导实验性肝硬化大鼠的形成过程中,白介素18(IL-18)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)的变化及意义.方法将80只清洁级雄性SD大鼠随机分为正常对照组和造模2周组、4周组、6周组,每组20只.予以CCl4复合因素诱导大鼠肝硬化,并在2、4、6周3个时间点分别处死6只大鼠.采用ELISA法检测大鼠血清IL-18、TNF-α、IFN-γ和肝脏组织匀浆上清液中的IL-18含量;HE染色观察肝脏的组织病理学变化.结果①CCl_4复合因素诱导的实验性大鼠,组织病理学观察发现,2周时大鼠肝脏组织细胞肿胀变性,6周时有大量纤维增生,部分肝组织有假小叶的形成;②随着造模时间的延长,实验大鼠血清IL-18、TNF-α、IFN-γ水平逐渐升高,造模6周组与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);③造模组肝脏组织匀浆中IL-18随肝损害程度的加重而升高,造模6周组与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论在CCl_4复合因素诱导大鼠肝硬化的形成过程中,IL-18、TNF-α、IFN-γ水平逐渐升高,提示该3种细胞因子与肝硬化的形成及发展有关.
【期刊名称】《西安交通大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2010(031)002
【总页数】4页(P148-150,185)
【关键词】大鼠;肝硬化;白介素18;肿瘤坏死因子α;γ干扰素
【作者】党双锁;高宁;程延安;边静;王顺达;孙明珠
【作者单位】西安交通大学医学院第二附属医院感染科,陕西西安,710004;西安交通大学医学院第二附属医院感染科,陕西西安,710004;西安交通大学医学院第二附属医院感染科,陕西西安,710004;西安交通大学医学院第二附属医院感染科,陕西西安,710004;西安交通大学医学院第二附属医院感染科,陕西西安,710004;西安交通大学医学院第二附属医院感染科,陕西西安,710004
【正文语种】中文
【中图分类】R512.6
肝硬化是慢性肝损伤所共有的终末病理改变。

在肝硬化的形成中，有大量细胞因子通过参与调节组织细胞的损伤修复过程而发挥作用[1]。

新近发现，白介素18（interleukin-18，IL-18）是新的致炎因子。

研究发现，IL-18参与了免疫调控，其过度表达可能引起免疫系统紊乱和组织器官的免疫炎性损害。

本研究通过建立四氯化碳（CCl4）复合因素诱导的大鼠肝硬化模型，动态检测造模组大鼠IL-18及相关细胞因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）、γ干扰素（IFN-γ）水平的变化，初步探讨细胞因子在肝硬化形成中的作用及意义。

1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器 CCl4（分析纯）购自西安化学试剂厂；橄榄油（化学纯）、胆固醇（分析纯）购自上海化学试剂公司；大鼠IL-18定量ELISA试剂盒为美国Biosource公司生产，上海森雄科技有限公司进口分装；大鼠TNF-α、IFN-γ定量ELISA试剂盒购自上海西唐生物有限公司；RIPA裂解液购自北京索莱宝科技有限公司；DG3021型酶联免疫检测仪为华东电子管厂产品。

1.2 实验动物与分组清洁级雄性SD大鼠80只，3～ 4个月龄，体重 360～ 380 g，平均（367±14.12）g，购于西安交通大学医学院实验动物中心。

据肝硬化造
模时间长短将SD大鼠随机分成4组:正常对照组、造模2周组、造模4周组、造
模6周组，每组20只。

所有大鼠分笼饲养于西安交通大学医学院实验动物房。

正常对照组，自由取食且不做任何处理；造模2、4、6周组，每周2次皮下注射
400 mL/L CCl4橄榄油溶液3 mL/kg，首次剂量为5 mL/kg；同时给予高脂饲料（80%单纯玉米粉+20%猪油+0.5%胆固醇）作为唯一饮食，并以300 mL/L乙醇作为饮水饲养动物。

每周一、四注射，且注射前称体重。

于造摸2、4、6周时各
组分别随机选取动物6只，水合氯醛腹腔内麻醉，腹主动脉插管取血，并留取肝
脏做组织匀浆及40g/L甲醛溶液固定，常规石蜡切片，HE染色。

1.3 方法
1.3.1 ELISA 法测定血清 IL-18、TNF-α、IFN-γ水平血液3 000 r/min离心20 min，吸取血清，采用双抗体夹心ELISA法测定，严格按照说明书操作。

1.3.2 ELISA法测定肝组织匀浆中IL-18水平取大鼠部分肝脏组织，冰冷等渗盐水漂洗数次后，除去血液，滤纸吸干，称取1g肝组织，用手动匀浆器将肝组织在磷酸盐缓冲溶液（PBS）和0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟化物（PMSF）中充分研磨匀浆，100 000 r/min 4℃离心15 min，取上清液，采用双抗体夹心ELISA法测定，严格按照说明书操作。

1.4 统计学方法采用SPSS 13.0统计软件处理。

计量资料数据以¯x±s表示，进行单因素方差分析，各组间比较采用LSD-t检验。

P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 大鼠肝脏的组织病理学改变正常大鼠肝组织细胞大小一致，细胞排列呈条索状，以中央静脉为中心呈放射状，肝窦无狭窄，小叶及汇管区无炎细胞浸润（图
1A）。

CCl4复合因素诱导2周后，大鼠肝脏充血、肿胀，包膜紧张，镜下肝细胞肿胀，呈气球样变，以汇管区周围较明显（图1B）；4周后大鼠肝脏充血、肿胀
进一步加重，镜下见大面积肝细胞变性和坏死，坏死以小叶周围显著，汇管区少量
炎症细胞浸润及纤维组织增生（图1C）；6周后大鼠肝脏充血、肿胀消退，肝脏轻度萎缩，镜下汇管区纤维增生，并向小叶内伸展，见不完整假小叶形成（图
1D）。

2.2 大鼠血清 IL-18、TNF-α、IFN-γ水平的动态变化与正常对照组相比，造模2周组大鼠血清IL-18、TNF-α的差异有统计学意义（P＜0.01），而IFN-γ差异无统计学意义（P＞0.05）；4周、6周造模组大鼠血清 IL-18、TNF-α、IFN-γ明显增高，与正常对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。

各造模组间比较，6 周组 IL-18、TNF-α、IFN-γ水平较 2、4 周组明显升高，差异均有统计学意义（P ＜0.01，表1）。

图1 各组大鼠肝脏的组织病理学观察Fig.1 Histopathological changes of liver in each group（HE×100）A:正常对照组；B:造模 2周组；C:造模 4周组；D:造模 6周组。

表1 各组大鼠血清 IL-18、TNF-α、IFN-γ水平的比较Tab.1 Serum levels of IL-18，TNF-αand IFN-γin each group（n=6，¯x ±s）与正常对照组相比，*P＜0.01；与造模2周组相比，△P＜0.01；与造模4周组比较，#P＜0.01。

组别 IL-18（pg/mL） TNF-α（pg/mL） IFN-γ（pg/mL）正常对照组47.48±4.51 -163.22±29.23 148.27±12.66造模2周组427.10±165.23* 27.38±19.08* 2 238.23±2 428.68造模4周组673.64±168.61*△ 54.27±27.50* 5
152.83±956.84*△造模6周组1 101.66±355.42*△ 109.78±39.19*△# 8 234.67±3 473.52*△#
2.3 大鼠肝组织匀浆中IL-18水平的变化与正常对照组相比，4、6周造模组大鼠肝组织匀浆中IL-18增高，差异有统计学意义（P＜0.01），且6周组肝组织匀浆中IL-18较2、4周组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01，表2）。

表2 各组大鼠肝组织匀浆中IL-18水平的比较Tab.2 Content of IL-18 of
hepatic homogenate supernatant in each group （n=6 ，¯x ±s）与正常对
照组相比，#P＜0.01；与造模2、4周组相比，△P＜0.01。

组别IL-18（pg/mL）正常对照组138.63±194.41造模2周组106.50±111.66造模4周组
305.27±173.15#造模6周组502.34±310.04#△
3 讨论
1995年OKAMURA等[2对感染疮疱棒状杆菌（P.acnes）的小鼠肝脏提取物用
脂多糖（LPS）加强刺激，可诱导出使IFN-γ高水平表达的因子，最初把该因子称作 IFN-γ诱导因子（IGIF）。

进一步研究发现，这是一种新的炎性细胞因子，有
亲多种组织的免疫活性，命名为白介素18[3]。

目前研究发现，IL-18是由活化的
巨噬细胞产生的一种强有力的免疫调节细胞因子，具有多种生物学活性:诱导Th1
细胞、NK细胞等多种免疫细胞产生IFN-γ、TNF-α、Fas配体及穿孔素；促进T
细胞增殖[4]；增强FasL介导的T h1细胞、自然杀伤细胞（NK）的细胞毒活性作用，导致肝实质细胞的免疫性损伤[5]。

本研究结果表明，在CCl4复合因素诱导大鼠肝硬化形成的6周中，血清细胞因子IL-18、TNF-α、IFN-γ水平均高于正常对照组；同时在诱导的不同时间点收集大
鼠肝脏组织，测定肝组织匀浆中IL-18的含量，结果发现随着肝硬化程度的加重
IL-18含量逐渐升高。

提示IL-18参与了肝脏炎症、肝硬化的发生发展过程，且
IL-18、IFN-γ、TNF-α等细胞因子呈网络调控，相互诱生，共同发挥作用。

国外
学者研究报道，在原发性胆汁性肝硬化时，体内炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-8等）也同样升高，并认为其在原发性胆汁性肝硬化的形成中起重要作用[6-8]。

也有学
者报道，酒精性肝硬化的形成是由于致炎因子与抗炎因子（IL-2、IL-10、TGF-β等）相互制衡失调而发生的。

我们的研究结果也证实，在CCl4复合因素引起的肝硬化形成中，IL-18、IFN-γ、TNF-α发挥了协同作用。

至于其作用机制，结合现有学者的研究结果分析，可能是细胞因子之间通过自分泌或旁分泌机制的网络调节
而致肝硬化的形成[9]:①IL-18可通过诱生IFN-γ和其他细胞因子（IL-2、GM-CSF、TNF-α等）的产生而形成IL-18/Th1细胞因子组成的细胞因子级联而发挥作用[10]；②作为炎性细胞因子的IL-18还可刺激免疫细胞（Th1细胞、NK细胞等）释放更多的细胞因子，如IFN-γ、TNF-α等，形成正反馈的放大作用，产生更多的ECM，从而导致肝纤维化乃致肝硬化的形成[11]。

愈来愈多的研究表明，IL-18作为一种重要的前炎症因子，在感染、肿瘤等多种疾病中发挥作用[12-16]。

本研究也证实了IL-18在肝损伤到肝硬化的形成过程中的作用。

因此，测定IL-18不仅可作为临床判断病情进展的一项有益指标，同时也可作为治疗靶点为治疗肝硬化提供新的途径。

相信随着对IL-18及其他细胞因子认识的进一步深入，将为阐释肝脏疾病的发生机制及防治提供更加有意义的依据。

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