第6章 抗生素类药物的分析

第6章抗生素类药物的分析
抗生素是指在低微浓度下即可对某些生物的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称。

是细菌、放线菌和真菌等微生物的代谢产物，对各种病原微生物有强大的抑制或杀灭作用。

6.1概述
临床应用的抗生素，主要由生物合成-微生物发酵培养、经化学纯化、精制和化学修饰制得。

与化学合成相比，生物合成制备的抗生素，包括临床应用的抗生素，主要由生物合成发酵和提纯两大步骤。

由于发酵工艺过程复杂，不易控制。

6.1.1 抗生素类药物的主要特点
1．化学纯度较低。

虽经精制提纯，一般仍含有杂质，存在较多的同系物，较多的异构体，并且降解的产物多。

2．活性组分易发生变异。

微生物菌株的变化、发酵条件的变化均可引起产品质量的变化。

3．稳定性差。

抗生素分子结构中的活泼基团不太稳定，易分解使其疗效降低，或使其失效，有时甚至引起毒副作用。

4．制备过程中易被异物污染的可能性大。

6.1.2 抗生素类药物的常规检查项目
为了保证用药的安全有效，各国药典都制定了抗生素标准，规定了抗生素类药物的杂质检查项目和含量测定方法，从而保证测定结果的可靠性。

抗生素类药物的常规检验项目主要包括以下三个方面：
1．鉴别试验
用化学方法、理化方法以及生物学方法鉴别其属何种抗生素、何种盐或酯类，包括有官能团的显色反应、光谱法、色谱法和生物学法。

2．杂质检查
抗生素类药物的检查项目除一般杂质检查外，还有以下一些特殊的检查项目。

1）毒性试验限制药品中引起急性毒性反应的杂质。

2）热原试验限制药品中引起体温异常升高的致热杂质。

3）降压试验限制药品中含有降低血压的杂质。

4）无菌试验检查药品中细菌污染的情况。

5）澄明度检查限制药品中不溶性杂质。

6）水分测定限制药品中水分含量。

7）特殊杂质检查用化学及理化方法检查药品中某些特殊杂质的含量或提取溶剂的残留量。

此外，某些抗生素，如灰黄霉素，其粒度与疗效有关，故规定控制结晶颗粒的大小。

3．效价测定
抗生素的有效成分含量测定方法，主要分为微生物学法和化学及物理化学法两大类。

1）微生物学法是以抗生素抑制细菌生长的能力或它的杀菌力作为衡量效价的标准。

其原理与临床应用的要求一致，有利于确定抗生素的医疗价值。

该法灵敏度高，所需供试品量少，既适用于较纯的精制品，亦适用于纯度较差的产品，对已知分子结构或结构不明确的抗生素均能应用。

对同一类型的抗生素不需分离，可一次测定其总效价。

但该法操作繁琐，测定时间长，误差较大。

2）理化分析法对于提纯的、化学结构已确定的抗生素，可用化学及物理化学方法测定。

本类方法是根据抗生素的化学结构特点，利用其特有的化学或物理化学性质而进行的。

如果是利用某一类型抗生素的共同结构的反应，其测定结果往往只能代表总的含量，不一定能代表某一抗生素的生物效价。

只有当本法的测定结果与生物效价相吻合时，才能用于效价
测定。

该法操作简便、省时、方法准确。

3）抗生素活性表示方法
抗生素的活性以效价单位表示，即指每毫升或每毫克中含有某种抗生素的有效成分的多少。

用单位（U ）或微克（μg ）表示。

如1mg 青霉素钠定为1670单位；1mg 的庆大霉素定为590单位；1mg 的硫酸卡那霉素定为670单位。

一种抗生素有一个效价基准，同一种抗生素的各种盐类的效价可根据其分子量与标准盐类进行换算。

例如：1mg 的青霉素钾的单位（U ）=5
.3724
.3561670
=1598U/mg 。

抗生素是临床上常用的一类重要药物，世界各国都广为生产和应用。

近年来，用于医疗的抗生素有300余种，一般多按化学结构和性质进行分类，如内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、酰胺醇类、多肽类、林可霉素类和其它抗生素类。

本章主要讨论β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类抗生素的结构和性质、鉴别反应和含量测定的原理与方法，及其质量控制的有关问题。

6.2 β-内酰胺类抗生素的分析
本类抗生素包括青霉素类和头孢菌素类，它们的分子中都含有β-内酰胺环，故统称为β-内酰胺类抗生素。

6.2.1 基本结构与主要理化性质
1．基本结构
1）青霉素类和头孢菌素类的基本结构
N
S
COOH
CH 3CH 3
RCONH
O
1
2
3
45
6
7
N
S
RCONH
O
1
2
6
78
COOH
CH 2R 1
3
4
5
青霉素类 头孢菌素类 2）结构特点
青霉素类的分子结构是由侧链CRO-及母核[6-氨基青霉烷酸（6-aminopenicillanic acid,
简称6-APA ）]两部分结合而成。

6-APA 母核中含有一个β-内酰胺环和氢化噻唑环，所以青霉素的母核实为β-内酰胺环与氢化噻唑环并合的双杂环；头孢菌素类分子结构由侧链CRO-及母核[7-氨基头孢菌烷酸（7-aminocephalosporanic,简称7-ACA ）]两部分组成，7-ACA 母核中含有一个β-内酰胺环和氢化噻嗪环，故头孢菌素的母核实为β-内酰胺环与氢化噻嗪环并合的双杂环。

青霉素类分子结构中C 3 和头孢菌素类分子结构中C 4上均有一个酸性较强的游离羧基，能与无机或有机碱形成盐（如普鲁卡因青霉素，青霉素钾钠等）。

青霉素分子结构中含有三个手性碳原子C 3、C 5、C 6, 头孢菌素结构中含有两个手性碳原子C 6、C 7。

青霉素族母核中无共轭系统，但其侧链酰胺基上R 基如具有苯环或共轭体系，则有紫外吸收。

头孢菌素族由于母核O=C —N —C=C 及R 取代基具有苯环等共轭系统，有紫外吸收。

由于它们分子结构中R 和R1不同，而构成了各种不同的青霉素和头孢菌素。

《中国药典》（2010年版）收载的青霉素族和头孢菌素族药物达50余种，部分β-内酰胺药物列于表6-1。

表6-1 β-内酰胺类抗生素的鉴别、检查和含量测定
抗生素名称
20][D
%
11cm E
鉴别 特殊杂质检查 含量测定
阿莫西林 amoxicillin 水溶液 +290。

～+315。

/ HPLC,IR 有关物质、聚合物
HPLC 法
阿莫西林钠 amoxicillin sodium 水溶液 +240。

～+290。

/ HPLC,IR, Na + 有关物质 HPLC 法
氨苄西林 ampicillin 水溶液 +280。

～+305。

/ IR N ，N’-二基苯基 HPLC 法
氨苄西林钠 ampicillin sodium /
/
HPLC,IR, Na + 有关物质、二氯甲烷
HPLC 法
哌拉西林 piperacillin 无水乙醇 +160。

～+178。

/ HPLC 、IR 、羟肟酸铁
/ HPLC 法
哌拉西林钠 piperacillin sodium
水溶液 +175。

～+190。

/ HPLC,Na + 羟肟酸铁
/ HPLC 法
头孢他啶ceftazidine / 磷酸盐缓冲液
λ257nm400～430
HPLC,IR, 吡啶，聚合物HPLC法
头孢曲松钠ceftriaxone sodium 水溶液
-153。

～-170。

水溶液
λ241nm495～545
HPLC,IR, Na+结晶性,有关物
质,聚合物
HPLC法
头孢呋辛钠cefuroxime sodium 水溶液
+55。

～+65。

水溶液
λ274nm390～425
HPLC,IR, Na+有关物质,聚合
物
HPLC法
头孢呋辛酯cefuroxime axetil / 甲醇
λ276nm390～420
HPLC,IR 结晶性，异构
体，有关物质
HPLC法
头孢拉定cefradine 醋酸盐缓冲液
+80。

～+90。

/ HPLC,IR,TLC 结晶性，头孢氨
苄，聚合物，有
关物质
HPLC法
头孢哌酮cefoperazone 磷酸盐缓冲液-
乙腈，-30。

～-38。

/ HPLC、羟肟酸
铁
/ HPLC法
头孢哌酮钠cefoperazone sodium 水溶液
-15。

～-25。

/ HPLC,IR, Na+聚合物，有关物
质，丙酮
HPLC法
头孢氨苄cefalexin 水溶液
+149。

～+158。

水溶液
λ262nm220～245
HPLC,IR, 有关物质HPLC法
头孢羟氨苄cefadroxil 水溶液
+165。

～+178。

/ HPLC,IR, 结晶性，有关物
质
HPLC法
2．主要理化性质
1）酸性与溶解度
青霉素和头孢菌素分子中的游离羧基具有较强的酸性（大多数青霉素类药物的pKa值在2.5～2.8之间），能与无机碱或某些有机碱形成盐。

其碱金属盐易溶于水，而青霉素的有机碱盐难溶于水，易溶于有机溶剂。

青霉素的碱金属盐水溶液遇酸则析出游离基的白色沉淀。

2）旋光性
青霉素、头孢菌素分子中均含有手性碳原子，故具有旋光性。

根据此性质，可用于定性、定量分析。

3）紫外吸收特征
青霉素分子中的母核部分无紫外吸收，但其侧链部分具有苯环或萘基共轭系统，则有最大吸收，如青霉素钠的R基为苄基，在257和264nm处有最大吸收；头孢菌素类由于母核部分具有O=C—N—C=C结构，故在260nm处有最处有最大吸收，如头孢氨苄的水溶液在262nm处有最大吸收。

4）β-内酰胺环的不稳定性
干燥纯净的青霉素很稳定，对热也稳定。

而青霉素的水溶液很不稳定，其分子中最不稳定部分是β-内酰胺环，易受亲核性或亲电性试剂的进攻，在酸、碱、青霉素酶以及某些氧化剂的作用下，β-内酰胺环易分解或发生分子重排，产生一系列降解产物，从而失去抗菌作用。

与青霉素相比，头孢菌素较不易发生开环反应，头孢菌素对青霉素酶和稀酸比较稳定。

青霉素类药物降解反应过程较为复杂，不同的条件得到不同的降解产物。

例如本类药物的降解反应见图6-1和图6-2。

S
HN
C ROCHN N
O
OH
CH 3CH 3COOH
S
HN
C ROCHN
O
OH
CH 3CH 3COOH
C
S
N N C
R
CH 3CH 3COOH
青梅噻唑酸
α-酰基羟胺酸
CH
COOH 青霉酸
青霉素
HS
HN
C
O
CH 3CH 3COOH
O
NH HC
青霉烯酸
100℃
H 2O,H +
CH 2CONHCH 2CHO
+C
C
CH 3
CH 3SH
H 2N
COOH
青霉醛
青霉胺
HgCl 2
图9-1 青霉素类药物的降解反应
β-2
C CHOH NHR RCOHN
O C C
CHNH 2NHR
RCOHN
O
派那地酸衍生物
派那马地酸衍生物
图9-2头孢噻吩钠的降解产物图
5）与氧化剂作用
青霉素与氧化性试剂氨制硝酸银试液、碱性酒石酸铜试液等作用，可被氧化，产生黑色的金属银或红色氧化亚铜沉淀，可作为鉴别反应。

6）与羟胺作用
青霉素可与羟胺作用，则β-内酰胺环被打开，生成青霉素的羟肟酸衍生物。

头孢菌素亦有类似反应。

6.2.2 鉴别反应
1．钾、钠盐的焰火反应
青霉素类和头孢菌素类抗生素，许多制成钾盐或钠盐供临床使用，因而对于钾盐或钠盐，可利用其焰火反应进行此类药物的鉴别。

2．呈色反应
1）与硫酸及硫酸−甲醛试剂呈色反应
多数青霉素类和头孢菌素类化合物遇硫酸在冷时和加热时均无变化，而遇硫酸−甲醛试剂有较显著的颜色变化，可供鉴别。

2）羟肟酸铁反应
β-内酰胺环与羟胺反应生成羟肟酸衍生物，在中性溶液中与铁离子作用生成红色配合物。

N S
RCONH
O
COOH CH2R1
H NOH HCl
25C HN
S
RCONH
O
COONa
CH2R1
FeNH(SO)
+C HN
S
RCONH
O
COOH
CH2R1
NHOH
NH
Fe/3
O
红色
中国药典收载的呱拉西林、哌拉西林钠、头孢唑林钠和头孢哌酮等的鉴别，均采用此法鉴别。

3）硫酸硝酸呈色反应
头孢菌素能与硫酸硝酸反应后呈色。

反应机制不清，但此显色反应可区别某些头孢菌素
族抗生素，因此被一些国家采用供鉴别。

4）茚三酮反应
某些具有氨基酸的本类药物，可遇茚三酮显蓝紫色。

5）与斐林试剂反应
本类药物具有类似肽键结构，可产生双缩脲反应。

开环分解，使碱性酒石酸铜盐还原显紫色。

6）与重氮苯磺酸呈色反应
头孢菌素7位侧链含有—C6H5OH基团时，能与重氮苯磺酸试液产生偶合反应，显橙黄色。

3．沉淀反应
1）在稀盐酸中产生沉淀的反应
青霉素钾（钠）盐的水溶液，加稀盐酸2滴，即析出难溶于水的游离的白色沉淀。

此沉淀能溶于过量的盐酸、乙醚、醋酸戊酯、乙醇或氯仿中。

2）有机胺盐的特殊反应
重氮化−偶合反应：普鲁卡因青霉素水溶液酸化后，游离出的芳伯胺基，显重氮化偶合反应，生成偶氮染料的红色沉淀。

二苄基乙二胺鉴别：苄星青霉素为二苄基乙二胺与青霉素所成的盐，加碱碱化后，用乙醚提取，蒸去乙醚后的残渣含有二苄基乙二胺，加稀乙醇使残渣溶解，加苦味酸（三硝基苯酚）的饱和溶液，加热后放冷，即析出二苄基乙二胺苦味酸盐结晶。

重结晶后测定熔点，约为214℃。

4．吸收光谱法
1）紫外分光光度法
根据供试品的最大吸收波长进行鉴别：将供试品配制成一定浓度的水溶液，根据其吸收光谱的最大吸收波长进行鉴定。

采用此法鉴别的药品有头孢氨苄、头孢唑啉钠和头孢噻肟钠。

2）红外吸收光谱法
分子结构已知的抗生素原料药几乎都有其特征的红外光谱。

中国药典规定，在一定的条件下，将供试品的红外吸收图谱与标准对照图谱，进行对照应一致。

中国药品红外光谱集收载的青霉素钠的红外光谱图如下，见图6-3.
图6-3 青霉素钠的红外吸收光谱
5．色谱法
1）薄层色谱法
青霉素与头孢菌素可采用薄层色谱法进行鉴别。

中国药典收载的氨苄西林、阿莫西林、头孢拉定及头孢氨苄等均采用此法鉴别。

2）高效液相色谱法
在相同实验条件下，用高效液相色谱法分别测定供试品和对照品的色谱图，其主峰的保留时间应一致。

《中国药典》（2010年版）收载的头孢羟氨苄的鉴别方法如下：精密称取本品约30mg，置100ml的量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，取10μl进样，另取头孢氨苄对照品，同法测定。

供试品与对照品主峰的保留时间应一致。

9.2.3 特殊杂质的检查
本类抗生素的特殊杂质主要有高分子聚合物、有关物质、异构体等，一般采用HPLC 法控制其含量，也有采用测定杂质的吸光度来控制杂质量的。

1．聚合物
聚合物的检查采用分组排阻色谱法。

分组排阻色谱法的分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制。

色谱柱多以亲水硅胶、凝胶或经修饰凝胶如葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等为填充剂。

流动相通常为水溶液或缓冲溶液，流动相中可以加入适量的有机溶剂，但一般不应超过30%，流速不宜过快，一般为0.5～1.0ml/min。

系统适用性试验一般情况下同HPLC法，但在高分子杂质检查时，某些药物分组的单体与其二聚体不能达到基线分离时，其分离度的计算公式为：
高
单体与二聚体之间的谷二聚体的峰高=
R (6-1) 除另有规定外，分离度应大于2.0。

高分子杂质定量测定法：
1）主成分自身对照法 一般用于高分子杂质含量较低的品种； 2）面积归一化法
3）限量法 一般用于混合物中高分子物质的控制。

通常规定不得检查保留时间小于对照品保留时间的组分；
4）自身对照外标法 一般用于Sephadex G-10凝胶色谱系统中β-内酰胺抗生素中高分子杂质的检查。

在该分离系统中，除部分寡聚物外，β-内酰胺抗生素中高分子杂质在色谱过程中均不保留，即所有的高分子杂质表现为单一的色谱峰，以供试品自身为对照品，按外标法计算供试品中高分子杂质的相对百分含量。

2．有关物质和异构体
β-内酰胺类抗生素中多数药物规定有有关物质的检查，部分还检查异构体杂质，有关物质和异构体通常采用色谱法检查。

例6-1 头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查
头孢呋辛酯为口服头孢菌素前体药，在体内羧酸酯酶水解后形成头孢呋辛起抗菌作用。

头孢呋辛酯异构体的制备 取头孢呋辛酯对照品适量，精密称定，用流动相溶解(必要时可超声处理)并制成每1ml 中含0.2mg 的溶液，取此溶液在60℃水浴中加热至少1h ，冷却，即得头孢呋辛酯异构体-∆3的溶液；另取经紫外光照射24h 的本品适量，用流动相溶解并制成每1ml 中约含0.2mg 的溶液，得含头孢呋辛酯E 异构体的溶液。

色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.2mol/L 磷酸二氢铵溶液−甲醇(62︰38)为流动相；检测波长为278nm 。

分别取上述制得的两种异构体溶液各20μl 注入液相色谱仪，头孢呋辛酯A 、B 异构体、异构体-∆3及异构体E 峰的相对保留时间分别为1.0、0.9、1.2及1.7和2.1，头孢呋辛酯A 、B 异构体之间，头孢呋辛酯A 异构体与异构体-∆3之间的分离度应符合规定。

有关物质 取本品适量，精密称定，加流动相制成每1ml 中约含0.25mg 的溶液，作为供试品溶液；精密量取1ml 置100ml 的量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

取对照溶液20μl 注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度，使两主成分中任一主成分色谱峰的峰高约为满量程的20％，立即精密量取供试品溶液和对照溶液各20μl ，分别注入液相色
谱仪，记录色谱图至头孢呋辛酯A异构体峰保留时间的3.5倍，供试品溶液色谱图中如显杂质峰，量取各杂质峰面积，其中两个E异构体峰面积之和不得大于对照溶液两个主峰面积之和（1.0%），异构体
-
∆3峰面积不得大于对照溶液任一两个主峰面积之和的1.5倍（1.5%），其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液两个主峰面积之和的0.5（0.5%），所有杂质峰面积的和不得大于对照溶液两个主峰面积之和的3倍（3.0%）。

（供试品溶液中任何小于对照溶液两个主峰面积之和0.05倍的峰可忽略不计）
异构体取本品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释成每1ml中约含0.25mg的溶液，立即精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。

头孢呋辛酯A异构体峰的面积与头孢呋辛酯A、B异构体峰的面积和之比应为0.48～0.55。

3．吸光度
药典也常采用测定杂质吸光度方法来控制本类抗生素的杂质含量。

如青霉素钠的吸光度检查：取本品，加水制成每1ml中含1.80mg的溶液，照紫外-可见分光光度法，在280nm 的波长处测定吸光度，不得大于0.10；在264nm的波长处有最大吸收，吸光度应为0.80～0.88。

此法中264nm处吸收值可用来控制青霉素钠的含量，280nm处吸收值可用来控制杂质的含量。

4．有机溶剂
部分本类药物需检查有机溶剂，如氨苄西林钠需检查二氯甲烷（GC法）；头孢哌酮钠需检查丙酮（GC法）。

5．结晶性
固态物质分为结晶质和非结晶质两大类，可用偏光显微镜法和X射线粉末衍射法检查。

《中国药典》（2010年版）对头孢地尼、头孢硫脒、青霉素V钾等规定了结晶性检查。

6.2.4 含量测定
青霉素和头孢菌素含量测定可采用微生物法和理化测定法。

目前文献报道的理化测定法很多，本章重点讨论碘量法、汞量法、酸碱滴定法、紫外分光光度法及高效液相色谱法。

1．碘量法
1）原理：青霉素或头孢菌素分子不消耗碘，但用碱水解生成的降解产物可被碘氧化，从而消耗碘。

例如，青霉素类抗生素经碱水解的产物青霉噻唑酸，可与碘作用，，剩余的碘
用硫代硫酸钠滴定液滴定，根据消耗的碘量可计算药物的含量。

反应方程式如下：
N
S
RCONH
O
COOH
NaOH
C
NH
S
RCONH
COONa
CH 3CH 3
H
H
NaOOC
CH 3
CH3
青霉素
青霉噻唑二钠
第一步反应
RCONH
H C
S
NH
COONa
CH 3CH 3NaOOC
+4I 2+5H 2O +2HCl
CH(COOH)2
NHCOR
+CH 3CH
3
C SO 3H
CH COOH
NH 2
+2NaCl H
+8HI 第二步反应
I 2
+
2Na 2S 2O 3
2NaI
+
Na 2S 4O 6
过量
2）测定方法
注射用普鲁卡因青霉素（C 16H 18N 2O 4S.2H 2O 的相对分子质量为588.72g/mol ）的含量测定方法如下：精密称取本品约0.12g ，置100ml 的量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml ，置碘量瓶中，加1mol/L 的氢氧化钠溶液1ml ，放置20min ，再加1mol/L 盐酸溶液1ml 与醋酸与醋酸钠溶液（pH=4.5）5ml ，精密加入碘滴定液（0.01mol/L ）15ml ，密塞，摇匀。

在20～25℃避光放置20min ，用硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L ）滴定，至近终点时加淀粉指示液，继续滴定，并强力振摇，至蓝色消失；另精密量取供试品溶液5ml ，置碘瓶中，加醋酸−醋酸钠溶（pH=4.5）5ml ，摇匀，精密加入碘滴定液（0.01mol/L ）15ml ，密塞，摇匀，在20～25℃避光放置20min ，用硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L ）滴定，作为空白。

同时用已知含量的青霉素钠（钾）按上法同样测定作对照，算出供试品的含量，即得。

3）讨论
从上述反应原理可知，1mol 青霉素与8mol 的碘原子相当，可用于10～100μg/ml 供试品溶液的测定。

用本法测定含量时，受诸多因素的影响，如反应温度、加缓冲液后放置的时
间、加碘的量和氧化时间等，均能影响测定结果，故操作时应严格遵守规定的条件。

（1）碘离子的浓度一般认为用0.01mol/L碘液为宜，其中不应高于碘离子的浓度不应高于0.05mol/L：但滴定普鲁卡因青霉素时不应低于0.05mol/L。

（2）与碘作用的温度与放置时间在室温时，不经水解的青霉素分子与碘不起作用，但在38℃时则能消耗碘，因此温度不可过高。

应在20～25℃加碘液后避光放置20min即可。

为了克服温度影响造成的误差，可采用标准品对照，或用不同温度的换算因数校正。

（3）碘与普鲁卡因在酸性条件下会产生复盐沉淀，不仅影响终点的观察，而且会使测定结果产生偏差，故规定，在滴定近终点时加淀粉指示液，并强烈振摇，结果较好。

（4）本法的空白试验与一般的空白试验不同，是为了消除供试品中可能存在的降解产物及其它能消耗碘的杂质的干扰。

（5）碘与青霉噻唑酸作用时，溶液的pH值在4.5左右最好。

2．汞量法
原理青霉素分子不与汞盐反应，而其降解产物能与汞盐定量反应。

在碱性条件下青霉素的水解产物青霉噻唑酸进一步水解成青霉胺，能与汞盐定量反应，根据消耗汞盐的量可以计算青霉素的含量。

青霉素分子中的氢化噻唑环含有一个硫原子，开环后形成巯基，用汞盐滴定巯基化合物。

3．酸碱滴定法
原理青霉素或头孢菌素的β-内酰胺环可被稀碱水解，例如青霉素生成青霉噻唑酸衍生物。

此步水解系定量完成，可用于含量测定。

在水解前，将供试品溶液的pH值调至约为8，加入定量而过量的碱，在一定温度和时间反应后，剩余的碱用标准酸液滴定至pH值约为8，根据消耗的碱量计算青霉素的含量。

4．紫外分光光度法
1）酸水解法铜盐法
青霉素类抗生素在弱酸性下的降解产物青霉烯酸具有紫外吸收特征。

青霉烯酸在320～360nm 处有强烈吸收，但此水解产物不稳定，可加入铜离子，与青霉烯酸形成较稳定的螯合物，在320nm 处有最大吸收。

氨苄西林、羟氨苄青霉素等采用本法测定含量。

2）硫醇汞盐法
原理青霉素在咪唑催化下于氯化汞（0.001mol/L）的中性溶液（pH=6.8）中，在60℃能定量地形成稳定的青霉烯酸硫醇汞盐，在325～345nm处有最大吸收。

该方法专属性强、
快速、准确，易于掌握。

5．高效液相色谱法
高效液相色谱法在抗生素类药物的分析中应用日趋广泛，具有选择性强、重现性好的特点，可同时用于鉴别试验、杂质检查以及含量测定。

USP （24）所收载的青霉素类和头孢菌素类抗生素中，用高效液相色谱法测定含量的原料药已超过一半。

中国药典中采用该法的品种亦有较大的增加。

例6-2 头孢唑啉钠的含量测定 《中国药典》（2010年版） 1）色谱条件与系统适用性试验
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸氢二钠的枸橼酸溶液（取无水磷酸氢二钠1.33g 与枸橼酸1.12g ，加水溶解并稀释成1000ml ）−乙腈（88︰12）为流动相；检测波长为 254nm ；取本品约10mg ，加0.2％氢氧化钠溶液10ml 使溶解，静置15～30min ，精密量取1ml ，置10ml 量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，取10μl 注入液相色谱仪，记录色谱图，头孢唑林的保留时间约为7.5min 。

头孢唑林峰和相邻杂质峰的分离度应符合要求。

2）测定方法
测定法 取本品适量，精密称定，加流动相溶解并定量制成每1ml 中约含0.1mg 的溶液，摇匀，精密量取10μl 注入液相色谱仪，记录色谱图；另取头孢唑林对照品适量，加磷酸盐缓冲液（pH=7.0）5ml 溶解后，再用流动相稀释，同法测定。

按外标法以峰面积计算供试品中C 14H 14N 8O 4S 3的含量。

3）计算
%P)
m(m )/A (A R
R X 1001%⨯-⨯=
含量 (6-2)
式中：A X 为供试品的峰面积或峰高，A R 为对照品的峰面积或峰高, m 为供试品的称样量(g), m R 为对照品的称样量（g ）, P 为供试品中水分的含量百分率。

6.3 氨基糖苷类抗生素的分析
本类抗生素是由碱性环己多元醇（氨基环醇）与氨基糖缩合而成的苷，故称为氨基糖苷类抗生素。

又由于其分子结构中都含有多羟基，故又称为多羟基类抗生素。

氨基糖苷类抗生素主要有链霉素、庆大霉素、卡那霉素、巴龙霉素、新霉素、阿米卡星、硫酸奈替米星、硫酸西索米星、硫酸依替米星、硫酸小诺霉素、硫酸核糖霉素等。

它们的抗菌谱和化学性质都有共同之处。

本节仅以链霉素和庆大霉素为例进行讨论。

6.3.1 基本结构与主要理化性质
1．基本结构
链霉素由链霉胍、链霉糖和N-甲基-L-葡萄糖胺三个环状结构以苷键互相连接而成的。

链霉胍通过苷键与链霉糖相接，链霉糖以另一个苷键与N-甲基-L-葡萄糖胺连接成链霉双糖胺。

结构如下所示：
NH
OH
OH
NH2
C
H 2N
NH
*
OH
O
O
OH CHO
O O
OH
OH
CH 3
CH 3
NH
CH 2OH
C
NH
*
NH 2
1
23
45
6
1'2'3'
4'
1"2"
3"
4"5"*
链霉胍
链霉糖
N-甲基-L-葡糖糖胺
链霉双糖胺
庆大霉素是由绛红糖胺、脱氧链霉胺和加洛糖胺缩合而成的苷，包括庆大霉素C 1、C 1a 、C 2和C 2a 等，临床应用庆大霉素的复合物。

O
C
NH 2O R
3
R 2
R 1
HN
6'
1'
2'
3'
4'5'
*
H 2N
NH 2
O
HO
*
1
3
4
5
62
O
OH
NHCH 3
OH
CH 3
*
1"
2"
3"4"5"
*
*绛红糖胺
2-脱氧链霉胺
加洛糖胺。