载体系统第三章

三种不同基本类型：
♣无尾部的二十面体型
♣具尾部的二十面体型（大多数噬菌的构形）
♣线状体型
T2噬菌体结构示意图
噬菌体的核酸：
♣双链线性DNA（最常见） ♣双链环形DNA ♣单链环形DNA ♣单链线性DNA ♣单链RNA
2 噬菌体的生命周期
（1）溶菌生长周期噬菌体（烈性噬菌体）
（2）溶源生长周期噬菌体（温和噬菌体）
pBluescript SK (+/-) 2958 bp
pBluescript SK (+/-)噬菌粒载体的分子结构图
噬菌粒载体的优点
（1）具小分子量的共价、闭合、环状的基因基因组 DNA，可克隆高达10 kb的外源DNA；
（2）有ampr 等基因作为选择记号；
（3）拷贝数高；
（4）存在多克隆位点,可克隆达10 kb的外源DNA；
(yeast artificial chromosome, YAC)
真核生物染色体的几个最为重要的部位：
着丝粒、 端粒和复制起始点 YAC本身可小至8 kb（如pYAC2质粒），克隆 能力可达1000 kb以上。
六 细菌人工染色体载体
(bacterial artificial chromosome, BAC)
注意：λ噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA 大小只能： 38kb ~ 52kb。
体外包装：λ噬菌载体 + 尾部蛋白 + 头部蛋白
4 M13噬菌体载体
6.4 Βιβλιοθήκη Baidub单链环状正链DNA基因组。
作载体的优点：
(1) RF DNA 和SS DNA都可感染E.coli，产 生噬菌斑； (2) 无包装限制问题（可6倍于M13基因组）； (3) 复制以双链环形DNA为中间媒介； (4）易测出外源DNA的插入方向； (5）可产生能直接测序的单链DNA分子。
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型
3 质粒的命名
用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字 母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作 者或实验室名称，再加上质粒编号。 如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则
是分别取自该质粒的两位主要构建者F. Bolivar和R. L. Rodriguez，322为编号。
天然质 粒 相对分子质量 拷贝数 pSC101 ColE1 RSF2124 5.8×106 4.2×106 7.4×106 1~3 20 10 单一酶切位点 EcoR I EcoR I EcoR I (BamH I) 选择性标记 tetr 大肠杆菌素 ampr 复制类型 严紧 松弛 松弛
2 质粒载体的选择标记
大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体
（五）质粒载体的稳定性问题
（1）不稳定性类型
♣分离不稳定性 ♣结构不稳定性
（2）影响稳定性主要因素
♣新陈代谢负荷 ♣拷贝数差度
二、噬菌体载体
1 噬菌体的结构及其核酸类型
2 噬菌体的生命周期 3 λ噬菌体载体 4 M13噬菌体载体
1 噬菌体的结构及其核酸类型
不同种类的噬菌体颗粒，在结构上有很大差别。
非接合型（non-conjugative plasmid)
(2) F质粒(fertility factor)
F+ 又叫雄性决定因子，所以F+细胞又叫雄性细胞，相 应的 F– 又叫雌性细胞。
F质粒(94kb)在寄主细胞中有三种不同存在方式： ① F+ ② F` ③ Hfr。
7 质粒的转化
转化（transformation）： 是将异源DNA分子引入另一细胞品系， 使受体细胞获得新遗传性状的一种手段。
三、 cosmid克隆载体
cosmid（cos site-carring plasmid）
人工构建的含有λDNA的cos位点 序列和质粒复制子的特殊类型的质 粒载体。
pHC79
柯斯质粒载体pHC79的形体图
由pBR322质粒DNA与λ噬菌体DNA的cos位点及其控制 包装作用的序列构成
部分柯斯质粒的基本特性
柯斯克隆（cosmid cloning）
理论依据是：
1）在线性噬菌体DNA分子的每一端，都具有一段彼此互补 的单链突出序列（cos位点)。 2）在λ噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个 λDNA拷贝组成的多连体分子。在此种分子中，前后两个 λDNA基因组之间都是通过cos位点连接起来的。
3）λ噬菌体具有的一种位点特异的切割体系(sitespecific cutting system),又叫Ter体系，能识别两个相 距适宜的cos位点(38-45kb)，将多连体分子切割成λ单位 长度的片段，并将它们包装到λ噬菌体头部中去。
据质粒DNA复制与宿主之间的关系分为：
（1）“严紧型”复制控制的质粒 (stringent plamid)：拷贝数少 ； （2）“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid)：拷贝数多。
6
质粒DNA的转移
(1) 质粒的类型 据能否自我转移可分为: 接合型（conjugative plasmid)
1 质粒的概念 质粒（plasmid）是独立于染色体外、具 有自主复制能力的遗传单位，其本质是较 小的核酸分子，大小范围在1kb-200kb以上 不等。
2 细菌质粒的一般生物学特性：
1）很多细菌中已发现； 2）是独立于细菌染色体之外的辅助性 遗传单位，基因组绝大部分为双链 环状DNA，不同质粒大小各异；
（4）具有较小的相对分子质量和较高的 拷贝数。
表达载体的必备条件
(1)能自主复制
(2)具有方便、灵活的克隆位点和筛择标记
(3)具有能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别的 强大启动子 (4)启动子应可受诱导调控
(5)具有强终止子
(6)具有翻译起始信号
1 天然质粒用作载体的局限性
局限性：分子量高、拷贝数低、合适的单一酶切 位点少、选择标记不合适
高的拷贝数 ♣适于组织化学方法检测重组体
♣具多克隆位点MCS区段
其它重要的质粒载体
改造过的质粒载体非常多
能 在 体 外 转 录 克 隆 基 因 的 质 粒 载 体
穿梭质粒载体
（shuttle plasmid vector）
是一类由人工构建的具有两种不同复制 起点和选择记号，因而可在两种不同的寄 主细胞中存活和复制的质粒载体。
3）大多数质粒的宿主范围较窄；
4）已发展进化出多种机制以维持其在 细菌宿主中的稳定的拷贝数；在不 同的宿主细胞中拷贝数可能不同。 5）复制转录的进行依赖于宿主编码的 酶和蛋白质； 6）常含有一些编码对细菌宿主有利的 酶的基因。
单链切割
连接
线性DNA （L型）
开环DNA （oc型）
单链切割
连接
共价闭合环形DNA （SC型）
λ噬菌体DNA的核酸内切限制酶的限制图（Kb）
（2） λ噬菌体载体
主要有如下特点： 1)筛选简便；
2)可克隆的片段大，最大可达23 kb， 而质粒最大仅10 kb左右； 3)转化效率高。
λ噬菌体载体可分为：
插入型载体 替换型载体
λ噬菌体载体是主要用于cDNA文库构建， 也经常用于外源目的基因的克隆。
4 质粒给宿主细胞的标记
(1) 氨苄青霉素 (Ampicillin ) (2) 卡那霉素 (Kanamycin) (3) 四环素（Tetracycline） (4) 氯霉素(Chloramphenicol) (5) 链霉素（Streptomycin）
(6）潮霉素（Hygromycin ）
5 质粒的复制类型
质粒转化细菌常用方法：热激法、电击法
（二）基因工程中的质粒载体
克隆载体(cloning vector) :
使目的片段能在细菌细胞中复制的载体;
表达载体（Expression Vector ）:
使目的基因能在细菌细胞表达为RNA 或蛋白质的载体。
克隆载体必备条件
（1）具有复制起点 （2）具有抗菌素抗性基因(或其他标记 基因) （3）具有若干限制酶单一识别位点
基因（lacZ）的启动子及其 编码α-肽链的DNA序列；
（4）多克隆位点（MCS）
pUC18
pUC19
Insert
Lac Z`
Lac Z`
ampr
No insert
ampr
Insert
Blue
White
Lac Z
X-gal 蓝色化合物
X-gal
pUC质粒载体的优点
♣具更小的分子质量(2.69kb)和更
第二节 载体系统
一、质粒载体 二、噬菌体载体 三、cosmid克隆载体 四、噬菌粒载体 五、酵母人工染色体载体 六、细菌人工染色体载体
一、质粒载体
（一）质粒的一般生物学特性 （二）基因工程中质粒载体的构建 （三）pBR322质粒载体 （四）pUC质粒载体 （五）质粒载体的稳定性问题
（一）质粒的一般生物学特性
（2）温和噬菌体
（2）温和噬菌体的生活周期
裂解循环
溶源态
3 λ噬菌体载体
（1）λ噬菌体的分子生物学概述
（2）λ噬菌体载体
（1）λ噬菌体的分子生物学概述
λ噬菌体（温和型）颗粒中的DNA是一线 性双链DNA分子，长48 502bp，两端各有12 个碱基的5`凸出黏性末端是互补的。进入 细胞的λDNA通过两端的黏性末端环化。 λ噬菌体上有些基因可被取代而不影响其 生活周期。
（1）烈性噬菌体的生活周期
E.coli T4噬菌体的生命周期（以分钟记）
噬菌体吸附到寄主菌的细胞壁，大约在吸附的2秒钟内 就会发生噬菌体DNA的注入； t=1 寄主DNA、RNA和蛋白质的合成反应被全部关闭； t=2 第一个噬菌体mRNA开始合成； t=3 细菌DNA开始降解； t=5 噬菌体DNA合成开始启动； t=9 “晚期”噬菌体mRNA开始合成； t=12 出现完整的头部和尾部结构； t=15 出现头一个完整的噬菌体颗粒； t=22 细菌发生溶菌作用，释放出约300个左右的噬菌体时粒 t=0
(如EcoR I)
38kb~52kb
四 噬菌粒载体 （phagemid vector)
由质粒载体和单链噬菌体载体结 合而成的新型载体系列，称为噬菌 粒（phagemid或phasmid）
几种常用的噬菌粒载体的一般特征
噬菌体 pEMBL8 质粒 pUC8 单链噬 辅助噬菌体 大肠杆菌 菌体 寄主菌株 f1 M13 IR1 71/18
DNA连接酶
pBR322质粒载体tetr基因插入失活效应
1遗传检测法
1）抗药性标志的选择
Amp Tet 插入片段
pBR322
Tet平板
Amp平板
（四）pUC质粒载体
含四个部分：
MCS
lacZ`
Ampr Ori
（1）来自pBR322的质粒 复制起点（ori）； （2）ampr ;
（3）大肠杆菌β半乳糖苷酶
（5）可用组织化学显色反应筛选重组子；
（6）具质粒复制起点，在无辅助噬菌体存在下， 克隆外源基因可按质粒一样复制； （7）有单链噬菌体复制起点，在有噬菌体辅助感 染的宿主细胞中，可合成出单链DNA拷贝，并 包装成噬菌体颗粒分泌到培养基中。 (8) 可直接对克隆的基因进行核苷酸测序。
五 酵母人工染色体载体
BAC载体是建立在大肠杆菌的F因子（大小约 100kb）的基因础上；
人工构建的BAC较小（如pBeloBAC11仅有7.4 kb，保留了与F因子的自主复制、拷贝数控制及质 粒分配等功能相关基因），但其克隆能力可达300 kb以上，远大于柯斯质粒，但小于YAC。
作业：
选择标记的应用：
利用质粒编码的可选择标记选择目标菌落。
常用的选择标记： 抗氨苄青霉素、抗四环素、抗氯霉素和抗 卡那霉素等基因。
（三）pBR322质粒载体
pBR322质粒载体的形体图
Ampr
Tetr
Ori
pBR322质粒载体的结构来源
pBR322质粒载体的优点：
♣具有较小的相对分子质量(4363bp) ♣具有两种抗菌素抗性基因可供作 转化子的选择记号(Ampr和Tetr) ♣具有较高的拷贝数（松弛型）
pRSA101 πVX
pUC118/ pUC119 pBS
pUC18/ pUC19 pUC
M13
f1
M13变异株 XS127， XS101 M13K07 MV1184 M13K07 XL-Blue
puC118和 pUC119噬 菌粒载体 的分子结 构
pUC118 (MCS) pUC119 (MCS)
柯斯质粒载体的特点：
1）具有λ噬菌体的特性（但因不含全部必需 基因，因此不能通过溶菌周期，无法形成 子代噬菌体颗粒）；
2）具有质粒的特性（有质粒复制子及抗菌素 基因）； 3）具有高容量的克隆能力（本身仅5-7kb, 克 隆极限可达45kb左右）；
4）具有与同源序列质粒进行重组的能力。 广泛应用于基因组DNA文库的构建。