正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠肠道菌群T-RFLP分析论文及综述

桂林医学院毕业设计（论文）
正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠肠道菌群多态性分析
院系: 生物技术学院
学号: *******
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专业: 2009级生物技术
****: ***
2013年5月22日星期三
正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠肠道菌群多态性分析2009级生物技术程骏指导老师朱嗣博
摘要【目的】设计应用T-RFLP技术，对正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠的肠道菌群进行多态性分析；【方法】设计一个引物的5‘末端用荧光物质标记（常用荧光物质有HEX,TET,6-FAM等），使样本DNA经PCR后都带有这种荧光物质；【结果】PCR 产物经纯化后酶切，可以先进行琼脂糖凝胶电泳，最后对酶切后的产物末端进行测序得到了T-RFLP 峰谱图, 该图谱能够快速准确地对不同种的菌群进行定性、定量的分析；【结论】成功使用T-RFLP技术对正常小鼠和IL10基因敲除小鼠的肠道菌群进行多态性分析，得到两种小鼠肠道菌群的差异性，经分析可以得到一种或几种菌群对于IL-10有特殊的联系。

对于IL-10的应用有重要作用。

关键词 T-RFLP技术；基因图谱；IL-10基因
Il-10 GENE knockout mice and normal mice intestinal flora
polymorphism analysis
2009-biotechnology Cheng Jun Supervisor ZhuSibo Abstract 【Objective 】Designing application of T - RFLP technique, the normal mice and IL-10 knockout mice intestinal flora polymorphism analysis. 【Methods 】Designing a primer 5 'terminal marked with fluorescent substances (commonly used fluorescent substance has a HEX, TET, 6 - FAM, etc.), after making the sample DNA by PCR with the fluorescent substance. 【Results 】PCR product after purification of the enzyme, can first carries on the agarose gel electrophoresis, finally after enzyme digestion of the end product sequencing got T - RFLP peak spectra, the map can rapidly and accurately for different kinds of microbes for qualitative and quantitative analysis. 【Conclusion 】Successful using T - RFLP technique of IL-10 knockout mice and normal mice intestinal flora polymorphism analysis, get the differences of two kinds of intestinal flora in mice, by the analysis of one or several kinds of bacteria can be have a special connection for the IL - 10. For the application of IL - 10 play an important role.
Key words T - RFLP technique; Gene mapping; Il-10 gene
首先介绍一下IL-10，在1989年，Mosmannand及他们的同事描述了一种新的免疫介质，由Th2细胞克隆分泌，能够抑制Th1细胞克隆IL-2和IFNr的合成。

早期被命名为细胞因子合成抑制因子（CSIF），这种因子后来被命名为IL-10，在这被发现的21年期间，很多研究深入剖析了这个细胞因子的生物学特性.
IL-10的分子量为35～40kd，通常为二聚体；主要由TH2细胞产生，也可由单核细胞、角质细胞及活化的B细胞产生。

IL-10能够抑制活化的T 细胞产生细胞因子，因此曾称为细胞因子合成抑制因子（csif），特别是抑制th1细胞产生il-2、ifnγ和lt等细胞因子，从而抑制细胞免疫应答。

IL-10可降低单核－巨噬细胞表面mhcⅡ类分子的表达水平，损害了apc的抗原递呈能力，实际上这可能是其抑制细胞介导免疫的原因。

此外，IL-10还能抑制NK细胞活性，干扰NK细胞和巨噬细胞产生细胞因子；但可刺激B 细胞分化增殖，促进抗体生成。

近年来分子生物学技术已被广泛地应用于微生物群落结构分析, 主要的研究方法包括: 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)、荧光原位杂交法( Fluorescence in situhybridization, FISH)、限制性酶切片段长度多态性分析法(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)、变性梯度凝胶电泳法 (Denaturinggradient gel electrophoresis, DGGE)和末端限制性片段长度多态性分析(Terminal restrictionfragment length polymorphism, T-RFLP)等[1]。

T-RFLP的技术原理是根据的保守区设计通用引物，其中一个引物的5‘末端用荧光物质标记，常用荧光物质有HEX,TET,6-FAM等。

提取待分析样的中DNA，以他为模板进行PCR扩张，所得到的PCR产物的一段就带有这种荧光标记，然后PCR产物有合适的限制性内切酶进行消化，一般选用酶切位点为4bp的限制性内切酶。

由于在不同细菌的扩增片段内存在核苷酸序列的差异，酶切位点就会存在差异，酶切后就会产生很多不同长度的限制性片段。

消化产物用自动测序仪进行测定，只有末端带有荧光性标记的片段能被检测到。

因为不同长度的末端限制性片段必然代表不同的细菌，通过检测这些末端标记的片段就可以反应微生物群落组成情况[2]。

这种方法还可以进行定量分析，在基因扫描图谱上，每个峰面积占总峰面积的百分数代表这个末端限制性片段的相对数量，即末端限制性片段的数量越大其所对应的面积越大[3]。

一、材料和实验流程
1、实验材料、试剂和设备
1.1实验材料：正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠的粪便以及它们的肠道组织。

样
本有两组,一组样本有十六个,另一组样本有八个。

1.2实验试剂：细菌基因组DNA 提取试剂盒，PCR 反应体系所需试剂DNA 聚合酶、
dNTP、buffer、上下游引物（自己设计，标记荧光，交由生工合成），纯化试剂盒，酶切反应体系所需试剂酶、buffer，DNA电泳液电泳所需试剂琼脂糖凝胶、电泳液、marker、loading等。

1.3实验设备：移液枪，枪头，PCR仪，金属浴仪，DNA电泳仪，灭菌锅，离心机，
振荡器，PH计，净化工作台，DNA分析测序仪（交由生工分析）等。

2、实验流程
2.1 细菌基因组DNA提取（小鼠粪便基因组提取试剂盒）
1）将样品加到2ml的EP管中；
2）加400ulAP1和4ulRNaseA，65℃温浴10min，每三分钟颠倒混匀一次（温浴时间可适当延长）；
3）加130ulAP2，混匀，冰浴5min，14000rpm 5min；
4）将上清转移到2ml吸附柱内，14000rpm 5min；
5）将收集管内上清移入一个新的EP管内，不可有沉淀，加入1.5倍的AP3，混匀；6）分次将混合液移入一个新的2ml吸附柱内，8000rpm 1min，弃掉收集管中液体；
7）将吸附柱移入一个新的收集管内，加500ulAW，8000rpm 1min，弃掉收集管中液体；
8）再加500ulAW，14000rpm 2min；
9）将吸附柱移入一个2ml的EP管内，加100ul超纯水（55℃）洗脱，室温静置5min，8000rpm 1min，在通风处放置1min，再重复一次效果更佳。

2.2 引物设计
上游引物8F(5′-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3′)，在5′末端加上荧光物质6-FAM 标记，下游引物806R(5′-GGACTACCRGGGTATCTAA-3′)，在5′末端用HEX进行标记[4][5][6]。

2.3 PCR扩增反应
O代替模板PCR 扩增反应体系采用50 μL, 模板量为2 μL, 阴性对照用ddH
2
DNA。

PCR 扩增条件为: 94 °C 5min;94 °C 30 s, 52 °C 30 s,72 °C 2 min, 共30 个循环; 72 °C 10 min。

PCR反应完成后用DNA凝胶回收试剂盒切胶回收800bp 位置的DNA条带。

2.4 限制性内切酶酶切
选用HhaⅠ作为实验的限制性内切酶。

酶切体系采用40 μL, PCR 产物为6 μL,在37 °C 酶切6 h, 反应完成后, HhaⅠ在65 °C 水浴中20 min失活。

2.5 琼脂糖凝胶电泳分析
在酶切完全之后，取5ul的酶切液进行电泳，140V，30min，看电泳条带，一般这个条带会很淡，因为主条带被切碎成很多的片段，大小不一，分布的很开，因此我们主要还是看800bp位置的条带是否还是存在，一般酶切完全之后这个位置的条带基本就已经没有了，其实在酶切的过程中就会进行多次电泳来决定其酶切的时间和程度，以便于及时停止酶切反应，保证酶切的质量。

2.6 T-RFLP分析的流程图
上面是两张简易的T-RFLP流程图，可以比较直观方便了解其实验的步骤：
2.7 T-RFLP图谱预处理
对于每个图谱，去除荧光强度小于100和片段大小≦35或者≥500的片段数据，将剩下片段的峰面积进行标准化处理，并去除相对丰度小于1％的片段[7][8]。

2.8 数据分析
将T-RFLP的数据转换成1～0矩阵（1表示有，0表示无），利用SPSS16.0中的聚类分析工具（Classifiy-hierarchical Analysis），采用非加权配对算法平均法对每组样本进行聚类分析。

接下来用软件SPSS16.0进行物种丰度（S）和Shannon-Weiner指数（H）的计算,结果用图表显示。

二、结果
用提取的八个粪便样本的基因组做PCR，电泳图如右：
八个样本的编号从左到右依次是：P3、21B、23、59A、
P1、29、47A、P4
前四个样本是干预组的，后四个是对照组。

每一组四个样本的小鼠都是经过相同处理的，通过电
泳图的观察来决定酶切时所加的PCR产物量的多少，
来保证酶切的DNA量接近，不会相差太多，导致误差
太大。

HhaⅠ酶切充分之后，进行DNA分析测序，得到T-RFLP
的图谱和原始数据。

图谱分析：
遵循的原则：Any fragment of ≦35 or ≥500bp was excluded；
T-RFs can vary over a range of 1~3 bp among different gels or lanes[9][10].
左面是干预组的
两张图谱，样本
号分别是23和
P3.《坐标表示-
（Size，
Height）》
同一组样本的图
谱在峰值区域的
存在基本上是一
致的，500bp以上
的峰值可能是没
有酶切开或者是
酶切不了的片
段，不作为参考
依据。

峰值的高
低差异在一定范
围内都是属于正
常的。

左面是对照组的
两张图谱，样本
编号分别是P1和
59.
这两张图谱的峰
情况基本相同，
差异不大。

比较对照组和干预组的图谱，不难发现这两组之间最大的差异大致就在size95bp~100bp间的峰。

接下来就进行具体的统计学分析，见表格一。

表格一：
从统计学分析中能看到差异较大的有两个区域，size大小分别是92bp~99bp，225bp~369bp。

三、讨论
人体肠道内有1014的细菌，包括大量的专性厌氧菌。

由于传统方法的局限，有不少的菌是无法进行培养的，因此一般分离培养方法只能分析出人肠道内40% 左右的细菌，导致研究的片面性。

而基于16srRNA 的T－RFLP不需要分离培养过程，理论上可以检测到微生态系统中所有的菌[11]。

IL-10基因的发现及IL-10细胞因子在动物体中的重要作用越来越引起大家的注意，特别是其在免疫系统中的作用。

现在有一些病人因为IL-10细胞因子的原因患了一些疾病，因此我们对IL-10进行了研究，我们通过T-RFLP技术对IL-10细胞因子在肠道菌群中的影响进行研究[12]。

通过T-RFLP技术得到的数据，我们可以初步判定IL-10基因对于小鼠的肠道菌群是有很大影响的，正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠之间肠道菌群存在很大差异，至少有一种或多种菌群在数量上差异很大[13]。

T-RFLP技术能够对微生态系统进行准确快速的动态检测，拥有易于自动化和数据共享等优势[14]。

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综述
T-RFLP技术在肠道菌群研究中的应用进展
［关键词］多样性; 肠道菌群
微生物群落的多样性一直是微生态学和环境微生物学研究的重点，在人类疾病的预防和治疗及机制研究中占据着举足轻重的地位。

随着分子生物学技术的迅速发展，人们不再满足单纯的依赖传统的培养及镜检方法对微生态进行研究，而越来越多的是从分子水平的角度去研究复杂的微生物群落组成及其多样性。

一种以PCR技术、RFLP技术和DNA测序技术为基础产生的准确、高通量、快速简便的对微生态系统进行动态检测的技术，即末端标记的限制性片段长度多态性分析( Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，T -RFLP)，成为人们研究各类微生物群落多样性的工具。

通过对带荧光标记片段(Terminal restriction fragment，T－RF)的大小、峰高和峰面积的分析得到目标系统的菌群结构，对生态系统的多样性进行分析及动态监测，因此拥有易于自动化、数据共享等优势。

本文就其在人体肠道微生物菌落分析中的应用和展望进行阐述。

1 T－RFLP 在人肠道菌群菌落分析的应用
人体肠道内有 1014的细菌，包括大量的专性厌氧菌。

由于传统方法的局限，有不少的菌是无法进行培养的，因此一般分离培养方法只能分析出人肠道内 40% 左右的细菌，导致研究的片面性。

而基于16s rRNA 的T－RFLP不需要分离培养过程，理论上可以检测到微生态系统中所有的菌。

Nagashima［1］通过对 8 个正常人粪便的 DNA T－RF分布与 TAP (T－RFLP analysis program)软件模拟分析的结果进行比较，得出适合用于检测人粪便菌群，尤其是双歧杆菌的新的引物－酶组合。

Mstsumoto 等［2］通过建立种系发生比对的数据库，印证了该方法可达到对人结肠群落种水平的分析，与TAP 数据库中的细菌种类有 80% 的匹配度。

Li 等［3］对 T－RFLP 的实验条件进行了优化，对总DNA提取的方法进行了摸索，最终得出该技术具有高通量、高重现性的特点，能很好的反映人类肠道菌群的结构特征的结论。

Anonia 等［4］对一个成年人的粪便进行分析，得到82个菌种，其中拟杆菌属、球形梭菌和柔嫩梭菌亚种占据了95%。

目前，由于数据库及相关资料的缺乏，只有24%的T－RF可以查出对应的菌种，如多形类杆菌、普拉梭杆菌、直肠真杆菌等。

1.1 T－RFLP 在研究各年龄阶段人体肠道菌群差异中的应用
人肠道内的菌群处于一个动态的变化中，不同生理阶段、不同的环境等都会造成菌群结构上的差异，这种动态平衡与人体健康息息相关。

婴儿粪便内的微生物群落保持基本稳定，而在断奶后则发生显著改变。

Sakata 等［5］利用 T－RFLP技术对婴儿肠道内进行群落分析，结果显示最初定植的主要是大肠杆菌、拟杆菌、肠球菌、链球菌、韦荣球菌属、葡萄球菌，前两种菌是婴儿母乳喂养期间的优势群落，在断奶后大肠杆菌的数量显著减少，而梭菌属的数量明显增加［6］，结果还显示微生物群落的分布特征具有明显的个体差异性。

在对不同生活方式的儿童粪便微生态变化的研究分析中，发现3个欧洲国家的儿童肠道菌群多样性与饮食结构有显著相关［7］。

人肠道菌群会随着年龄的增加而发生相应的变化。

Hide-nori 等［8］对6名老年人的肠道菌群进行了研究，T－RFLP 检测结果显示老年人肠道内主要的菌群为拟杆菌、梭杆菌Ⅳ，Ⅸ亚型菌种，梭杆菌ⅪVa 亚型菌种和γ－变形菌，其中梭杆菌ⅪVa亚型菌种的数量比健康成年人的含量低，同时在健康年轻个体肠道内多见的卵瘤胃球菌在老年人体内却未查见，而γ－变形菌则具有较高的检出率。

Hidenori 等［9］对3个尸检个体的各个肠段微生物进行T－RF分析，发现不同个体不同肠段的微生物菌群结构有着明显的差异。

Layer 等［10］使用 T－RFLP 技术分析人类粪便中的金黄色葡萄球菌，发现该技术具有在种水平上鉴定菌种的优势。

随着 T－RFLP 分析技术在人类微生物群落研究中利用的增加，人们将对自身特别是胃肠道内微生物群落结构有了更深入的了解，对很好的利用有益微生物，抑制有害种类及合理的预防和治疗相关疾病大有裨益。

1.2 T－RFLP 在肠道相关疾病临床诊治中的研究
人体健康是一个微生态平衡的问题，一旦这种平衡被打破，将导致疾病的发生，因此，检测肠道菌群的结构可能会成为一种有效的辅助诊断指标。

Wang 等［11］发现18位异位性湿疹患儿肠道菌群T－RF所反映的平均群落峰值和多样性指数均显著低于健康儿。

Akira 等［12］通过T－RFLP 对比分析溃疡性结肠炎病人及健康个体的肠道菌群，发现病人肠道内含有健康个体没有的胃瘤球菌属、真细菌、梭菌、γ－变形菌、非典型的拟杆菌和非典型乳杆菌。

同时
UC(ulcerative colitis)活跃期与非活跃期病人的肠道菌群也有差异，胃瘤球菌属、梭菌和真细菌的T－RFs主要在活跃期UC病人肠道内被检测到，而在非活跃期病人肠道内主要检测到的是乳酸杆菌和非典型乳酸杆菌。

在另一研究中，学者利用T－RFLP 分析出早产儿，尤其是滥用过抗生素的坏死性小肠结肠炎早产儿肠道菌群的多样性极为单一，且γ－变形菌占据优势［13］，显示出该技术用于多样性分析中的优势。

有资料提示一些疾病与肠道菌群的失衡息息相关，而突破传统分离培养方法的 T－RFLP 技术更能直观的反映菌群的失衡。

Mitsuharu［14］对医源老人及健康人肠道菌群结构及肠道多胺进行检测，发现包括 xylanlyticum 梭杆菌和saccharolyticum梭杆菌在内的梭杆菌ⅪVa 亚型菌种及种系的细菌与高浓度多胺的产生相关。

Dicksved等［15］研究发现患Crohn's 病的同卵孪生子肠道菌群多样性低于健康孪生子，证实了遗传和/或环境因素一定程度上影响了肠道微生物群落的构成。

詹銮峰等［16］针对16srRNA设计通用引物，利用T－RFLP技术分别对30例腹
泻患者和 22 例健康成年人粪便进行比较，腹泻患者均发现肠道菌群紊乱，为腹泻的诊断和治疗提供了一定的依据。

Khoruts 等［17］通过细菌疗法，将健康人的肠道菌群移植到由难治性梭状芽孢杆菌造成腹泻的病人体内，最终使供体与受体肠道菌群的T－RF趋于一致。

T－RFLP技术还被应用在对疾病治疗动态监测过程中，通过肠道菌群的动态变化来观测治疗的效果。

Kohyama［18］通过对实施过直肠结肠切除术病人的肠道菌群进T－RF分析，发现结肠菌群随时间发生显著的变化。

该技术在治疗顽固性UC的方法研究［19］、生物制剂对花粉过敏症的影响［20］，具十字花蔬菜对非蔬菜水果膳食人群肠道菌群的改善［21］，生物制剂对心血管疾病患者肠道菌群的改变［22］等方面都成为强有力的辅助检测方法。

人体中的肠道菌群是按一定比例定植在人肠道内的，具有生物屏障作用，其结构与功能与人的生命紧紧相连。

T－RFLP能快速、准确的将其变化反映出来，进而能为诊断及治疗提供便捷。

1.3 T－RFLP 在肠道菌群耐药性研究的应用
随着抗生素的滥用，抗生素的耐药性已经成为一个热门的研究领域及严重的公共卫生问题。

将研究细菌耐药性与T－RFLP技术相结合，可以从微生态角度进一步分析抗生素的耐药问题。

Cecilia 等［23］分别对服用克林霉素前、中、后的8个健康志愿受试者进行肠道菌群的分析，利用活菌计数和T－RFLP监测每个个体的肠道微生物群体的组成和特异性菌株丰度的变化及受到克林霉素影响的特异性菌群。

同时，该学者应用该技术对抗生素对肠道微生态可能的长期影响进行了监测［24］。

他先后分析4例病人应用7 d克林霉素后肠道微生态的变化，连续2年的T－RFLP监测结果发现用药组细菌群落的结构发生明显的持续性变化，且在观察期间始终没有恢复到用药前的水平，而对照组的群落只有轻微且短暂的变化。

4年的监测结果显示部分肠道菌群的多样性能恢复到用药以前，但是仍有部分特有菌群受到很大的影响［25］。

日本学者通过对出生后4天内使用了广谱抗生素的婴儿及在同时期母体注射过抗生素的剖腹产婴儿的肠道菌群T－RF片段进行分析，结果提示由于抗生素的使用，这些婴儿肠道菌群的数量及多样性，特别是双歧杆菌和肠球菌比健康婴儿少［26］。

有研究者对正常人在服用β－内酰胺类抗生素的过程中及服药后均进行微生态制剂干预(主要含有双歧杆菌和乳酸杆菌)，肠道菌群T－RF结果说明这种干预能加速肠道微生态平衡的恢复［27］。

因此，临床上可望通过微生态制剂的干预，改善由抗生素引起的肠道菌群紊乱，以求更好的维持人体的微生态平衡。

以上研究结果充分表明，利用T－RFLP技术也许能从另一个角度诠释细菌耐药性的产生机制及传递方式，为人类遏制不断增强的细菌耐药性，以及疾病的治疗提供一种新的思路。

1.4 T－RFLP 在人肠道系统与其他系统比较中的应用
通过全自动测序仪(genescan)分析得到的T－RFLP图谱包含了T－RF的片段大小、峰高及峰面积。

对图谱的结果作进一步的数据分析，可以比较不同生态系统中微生物群落结构。

通过常用的Shannon－Wiener 多样性指数(H') 的比较可以进一步明确各种微生物群落结构的相似性，以及同一群落在空间水平随时间而发生的变化［28］。

Lisa［29］通过分析T－RFLP数据，对包括人在内的多种动物肠道
菌群进行了对比分析，丰富了同源性研究的数据。

Bernhard 等［30］利用人粪和牛粪的T－RF峰图上各自的特征峰为依据来判断水的粪便污染源。

2 T－RFLP 技术的研究前景
T－RFLP不能对图谱进行杂交或者直接克隆测序，且由于数据库的不完善，酶切的T－RF片段在数据库中匹配度不够，有时无法鉴定到种属水平。

但这种作为不依赖培养的分析生物学分析方法，具有高通量、快速、准确、分辨率较高的特点，而逐渐被国内外学者所青睐。

RDP 数据库的丰富，TAP 分析软件的推出都给T－RFLP数据的处理带了方便。

T－RFLP 能分析的目的分子不仅限于16s rRNA。

选用某种功能基因作目的序列进行分析，就能确定具有这种代谢功能微生物的组成情况。

Marsh［31］研究发现延伸因子基因也可以应用于T－RFLP分析，目前延伸因子的数据库不够完善，但通过模拟分析获得的T－RF 片段较16s rRNA更多。

选择其它的系统进化标记做目的序列还能取得特殊的分析成果。

例如，选用16s rRNA可以调查群落中有代谢活性的菌的组成情况，这是因为有代谢活性的菌比处于休眠状态的菌含有更多的16s rRNA，16s rRNA就成为检测有代谢活性的细菌的一种指标。

目前，T－RFLP已广泛应用于环境学、地质地理学和微生物学的研究中，能够较为全面的分析生态环境中的多样性，并能动态监测菌群的变化。

随着该技术的不断完善、应用范围的不断扩大，相信T－RFLP势必在人肠道菌群与人类健康的研究领域中发挥重要的作用。

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