正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠肠道菌群T-RFLP分析论文及综述

桂林医学院毕业设计（论文）

正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠肠道菌群多态性分析

院系: 生物技术学院

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专业: 2009级生物技术

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2013年5月22日星期三

正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠肠道菌群多态性分析2009级生物技术程骏指导老师朱嗣博

摘要【目的】设计应用T-RFLP技术，对正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠的肠道菌群进行多态性分析；【方法】设计一个引物的5‘末端用荧光物质标记（常用荧光物质有HEX,TET,6-FAM等），使样本DNA经PCR后都带有这种荧光物质；【结果】PCR 产物经纯化后酶切，可以先进行琼脂糖凝胶电泳，最后对酶切后的产物末端进行测序得到了T-RFLP 峰谱图, 该图谱能够快速准确地对不同种的菌群进行定性、定量的分析；【结论】成功使用T-RFLP技术对正常小鼠和IL10基因敲除小鼠的肠道菌群进行多态性分析，得到两种小鼠肠道菌群的差异性，经分析可以得到一种或几种菌群对于IL-10有特殊的联系。对于IL-10的应用有重要作用。

关键词 T-RFLP技术；基因图谱；IL-10基因

Il-10 GENE knockout mice and normal mice intestinal flora

polymorphism analysis

2009-biotechnology Cheng Jun Supervisor ZhuSibo Abstract 【Objective 】Designing application of T - RFLP technique, the normal mice and IL-10 knockout mice intestinal flora polymorphism analysis. 【Methods 】Designing a primer 5 'terminal marked with fluorescent substances (commonly used fluorescent substance has a HEX, TET, 6 - FAM, etc.), after making the sample DNA by PCR with the fluorescent substance. 【Results 】PCR product after purification of the enzyme, can first carries on the agarose gel electrophoresis, finally after enzyme digestion of the end product sequencing got T - RFLP peak spectra, the map can rapidly and accurately for different kinds of microbes for qualitative and quantitative analysis. 【Conclusion 】Successful using T - RFLP technique of IL-10 knockout mice and normal mice intestinal flora polymorphism analysis, get the differences of two kinds of intestinal flora in mice, by the analysis of one or several kinds of bacteria can be have a special connection for the IL - 10. For the application of IL - 10 play an important role.

Key words T - RFLP technique; Gene mapping; Il-10 gene

首先介绍一下IL-10，在1989年，Mosmannand及他们的同事描述了一种新的免疫介质，由Th2细胞克隆分泌，能够抑制Th1细胞克隆IL-2和IFNr的合成。早期被命名为细胞因子合成抑制因子（CSIF），这种因子后来被命名为IL-10，在这被发现的21年期间，很多研究深入剖析了这个细胞因子的生物学特性.

IL-10的分子量为35～40kd，通常为二聚体；主要由TH2细胞产生，也可由单核细胞、角质细胞及活化的B细胞产生。IL-10能够抑制活化的T 细胞产生细胞因子，因此曾称为细胞因子合成抑制因子（csif），特别是抑制th1细胞产生il-2、ifnγ和lt等细胞因子，从而抑制细胞免疫应答。IL-10可降低单核－巨噬细胞表面mhcⅡ类分子的表达水平，损害了apc的抗原递呈能力，实际上这可能是其抑制细胞介导免疫的原因。此外，IL-10还能抑制NK细胞活性，干扰NK细胞和巨噬细胞产生细胞因子；但可刺激B 细胞分化增殖，促进抗体生成。

近年来分子生物学技术已被广泛地应用于微生物群落结构分析, 主要的研究方法包括: 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)、荧光原位杂交法( Fluorescence in situhybridization, FISH)、限制性酶切片段长度多态性分析法(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)、变性梯度凝胶电泳法 (Denaturinggradient gel electrophoresis, DGGE)和末端限制性片段长度多态性分析(Terminal restrictionfragment length polymorphism, T-RFLP)等[1]。T-RFLP的技术原理是根据的保守区设计通用引物，其中一个引物的5‘末端用荧光物质标记，常用荧光物质有HEX,TET,6-FAM等。提取待分析样的中DNA，以他为模板进行PCR扩张，所得到的PCR产物的一段就带有这种荧光标记，然后PCR产物有合适的限制性内切酶进行消化，一般选用酶切位点为4bp的限制性内切酶。由于在不同细菌的扩增片段内存在核苷酸序列的差异，酶切位点就会存在差异，酶切后就会产生很多不同长度的限制性片段。消化产物用自动测序仪进行测定，只有末端带有荧光性标记的片段能被检测到。因为不同长度的末端限制性片段必然代表不同的细菌，通过检测这些末端标记的片段就可以反应微生物群落组成情况[2]。

这种方法还可以进行定量分析，在基因扫描图谱上，每个峰面积占总峰面积的百分数代表这个末端限制性片段的相对数量，即末端限制性片段的数量越大其所对应的面积越大[3]。

一、材料和实验流程

1、实验材料、试剂和设备

1.1实验材料：正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠的粪便以及它们的肠道组织。样

本有两组,一组样本有十六个,另一组样本有八个。

1.2实验试剂：细菌基因组DNA 提取试剂盒，PCR 反应体系所需试剂DNA 聚合酶、

dNTP、buffer、上下游引物（自己设计，标记荧光，交由生工合成），纯化试剂盒，酶切反应体系所需试剂酶、buffer，DNA电泳液电泳所需试剂琼脂糖凝胶、电泳液、marker、loading等。