第5次课 天然产物研究实验室技术3(结构鉴定)

⑵得量少；⑶结构复杂。因此主要借助于光谱方法进行
综合解析，必要时结合化学降解，衍生物合成等方法。
一、化合物的纯度测定 1.检查晶形
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2.测定熔点
3.TLC或PPC检查：一般需要三种系统，且需
用通用显色剂显色（如硫酸、磷钼酸等）。
4.GC或HPLC
程序
方法 1.注意观察样品在提取、分离过程中的行为。
天然药物结构研究方法
• 结构研究是天然药物化学的一项重要的研究内容。从天 然药物中分离得到的单体即使具有很强的活性与较大的
安全性，但如果结构不清楚，则无法进行进一步的药效
学、毒理学、药物构效关系的研究，更不能进行人工合 成或结构修饰，改造工作，也不能进行新药开发，其学 术和应用价值将会大大降低。 • 天然化合物结构研究难度较大：⑴“ 未知”因素太多;
5. FAB-MS：快速原子轰击电离质谱
Fast atom bombardment ionization
6. ESI-MS：电喷雾电离质谱 Electrospray ionization
7. MALDI-MS：基质辅助激光解析电离质谱 8. API-MS：大气压电离质谱
1. 电子轰击质谱（EI-MS） electron impact ionization 样品经高温（300C）气化，气态分子受一定能 量的电子冲击而电离和裂解产生各种阳离子。
-CCC=C
70~100
110~150
、-不饱和醛
、-不饱和酮
175~196
180~213
常见13C-NMR谱类型及其特征：
①噪音去偶谱（proton noise decoupling spectrum）， 全去偶（ proton complete decoupling, COM）或 宽带去偶（broad band decoupling, BBD）。 特点：所有C信号均作为单峰出现
基团
CH3-伯碳 CH3-O-CH2-OCH-OCH- (叔碳) C (季碳)
C (ppm)
0~30 40~60 40~70 60~76 31~60 36~70
基团
Ar (芳环) Ar-y (取代芳环) -COOR（酯） -CONHR (酰胺) -COOH -CHO
C (ppm)
110~135 123~145 155~175 158~180 158~185 175~205
特征峰疏，易辨认
OH、NH2、COOH C-H 伸缩振动
1900-1650 cm-1 C=O 伸缩振动 1690-1600 cm-1 C=C 伸缩振动 1000-650 cm-1 C-H 弯曲振动
烯或芳环取代情况
指纹区：1250 ~ 400 cm-1 吸收峰密集，结构微小变化敏感
区别两个化合物是否相同
相应的13C和1H信号的垂直和水平连线的交叉点上。
13C-1H
COSY
检测13C
O O N O OH
HMQC（HSQC）
检测1H
（3）远程C-H相关
远程13C-1H相关（Long Range 1H-13C COSY ）
HMBC：异核多键相干谱（Heteronuclear
Multiple Bond Connectivity）
CH2=CH2 m/z 28
[M]+
M-rha-glc M-rha-rha M-rha-rha-glc M-rha
苷元
[M+1]+
FAB-MS
四、核磁共振谱（NMR, Nuclear Magnetic Resonance）
常 用 氘 代 溶 剂 杂 质 峰 及 水 峰
1. 1H NMR 通过化学位移（δ），积分曲线高度以及裂分情况可以判断
②DEPT(distortionless enhancement by polarization transfer) ：
照射1H核，将产生NOE效应从而使观测核的信号 强度增强，DEPT就是通过极化转移检测增强的13C信 号。
DEPT通过改变对1H核的第3个脉冲宽度（），
使设定分别为45、90和135来区别碳原子的种类，
1.2~1.8
α-H: +2~4 α-H: +1~2 β-H: +0.5~1 2~3 5~8 6~9
(R=OH, OCOR, OR, NO2, X) β-H: +1~2
－CHO
活泼氢（OH, SH, NH)
9~10
不定，加入D2O后消失
（2）峰面积：氢的数目
（3）信号的裂分:偶合常数（J）
s（singlet，单峰）
化合物 M1 M2 M3 M4 分子式 C8H12N4 C9H12N2 C10H12O2 C10H16N2 精确质量 164.1063 164.0950 164.0837 164.1315
4.不饱和度的计算：
III I u=IV+ +1 2 2
C25H30O15
u=25-30/2+0/2+1=11 CnHmOv
后产生化学键振动而形成的吸收光谱。
作用：功能基的确定，如羰基、双键、芳环等
应用：未知物鉴别、化学结构确定
化学反应检查、区别异构体
纯度检查、质量控制
环境污染监测等
CH3 HO
N
消旋山莨菪碱
O O C CH2OH CH
Aromatic ring
OH C=O
特征区：4000~1250 cm-1
确定功能基团 ＞3000 cm-1 ~ 2900 cm-1
d（doublet，二重峰）
t （triplet，三重峰）
q（quartet，四重峰）
m（multiplet，多重峰）
信号的裂分符合n+1规律
H CH2 O H H OH CH3 CH2
H CH3 CH2 CH2 H
2. 核磁共振碳谱（13C-NMR）
13C信号的裂分：符合n+1规律
q（CH3）、t（CH2）、d（CH）、s（-C-）。
分别得到只有甲基（CH3）、亚甲基（CH2）和次甲
基（CH）信号的图谱。
3.二维核磁共振（2D-NMR）
• 1H-1H COSY
•
13C-1H
COSY，HMQC
• 远程13C-1H COSY，HMBC
• NOESY
• TOCSY
（1）1H-1H COSY（correlation spectroscopy
三、质谱（MS, Mass Spectrometry） 原理：样品在质谱仪中生成阳离子，在稳定磁场 中按质核比（m/z）顺序进行分离，通过检测器纪录 下来。 质谱法可以给出化合物的分子量，根据裂解碎片 可以推断化合物的结构。 用途：元素分析，分子量测定，分子式确定， 糖、苷分子中单糖的连接顺序。
质谱的种类：
提供两键或大于两键，主要是三键的C-H偶
合信息，抑制了直接偶合信息（1JCH） ，建立CC间的关联，甚至越过氧、氮或其他原子的官能
团间的关联，特别解决由于屏蔽效应难以解释的
季碳归属问题。
O O N O OH
（4）NOESY（Nuclear Overhauser Effect
268 333 386
MeOH
MeONa
共轭双键：＞200 nm
3、芳环：取代苯环＞200 nm
黄酮类化合物
200
300
400
500
O MeO Rha(1-2)GlcO O
OH
OMe
二、红外光谱（IR, Infra-red Spectrometry）
原理：有机分子吸收红外光（500~4000 cm-1）
同一自旋偶合体系里质子之间的偶合相关， 3 2
对角线上出现的是一维1H-NMR的投影，对角线以
O 外信号称为交叉峰或相关信号，处于两个轴上质 7 1 6 子信号的水平和垂直连线的交叉点上，表明对应 2 9 CH3 8
的质子间相互自旋偶合。
10
3 4
5
A
B
（2）13C-1H COSY相关 C-H COSY HMQC：异核多量子相干谱 （heteronuclear multiple quantum coherence ） 直接键连的C-H间的偶合相关，一般谱图中X轴 为13C化学位移，Y轴为1H化学位移，交叉峰出现在
确定分子中含有的官能团 或结构片断，或基本骨架
2.测定并解析化合物的有关光谱：如 UV、IR、MS、
1
HNMR、13CNMR
3.结合文献调研
①综合分析光谱解析及官能团定性，定量分析结果 推断并确定分子的平面结构 ②与已知化合物进行比较或化学沟通（化学降解、 衍生物制备或人工合成）。 4.进一步确定立体结构 推断并确定分子的立 体结构（构型、构象） ①测定 CD 或 ORD 谱 ②测定 NOE 或 2DNMR 谱 ③进行 X-ray ④ 人工合成
2n+2-m u= 2 225+2-30 u= 2
HO OH OH OH O H OH HO OH OH O H H
HO O H OH
H OH
H OH
=11
天然产物结构鉴定主要波谱方法： 紫外光谱
红外光谱
质谱
核磁共振谱
旋光谱 圆二色谱 X-射线衍射
一、紫外光谱（UV, Ultra-Violet Spectrometry） 原理：有机分子吸收紫外光（200-500nm）后 产生电子振动而形成的吸收光谱。 应用：主要用于测定分子内的共轭系统。 1、饱和烃：无紫外吸收 2、不饱和脂肪烃： 孤立双键：200 nm
分子离子峰；碎片峰。
应用：苷元、易气化的小分子
M+
EI-MS
2. 场解析质谱（FD-MS）
原理：样品不经气化与载体表面形成薄膜，
在强电场作用下电离为阳离子。
应用：难挥发，热不稳定的糖、肽等
3. 快原子轰击质谱（FAB-MS）
原理：样品与甘油混合由载体引入，分子经快速
原子氩轰击后进入质谱仪。
应用：高分子、热不稳定、强极性的糖、肽等
分子量测定：冰点下降法（固体物质）、沸点上升法（液体 物质）、粘度法、凝胶过滤法，最常用质谱法（MS）。 EI-MS测得分子量为496，即（C10H16O）×n=496， n=496/152=3，分子式C30H48O3。 2.同位素峰度比法 一定的化合物其[M]+,[M+1]+,[M+2]+峰的强度为定值。 3.高分辨质谱（HRMS）法 可将物质的质量精确测定到小数点后第3位，因此每一个 化合物，即使有相同的分子量，其测得的精确分子量都不相 同，以此可求得分子式。
二、 结 构 研 究 的 主 要 程 序
初步判断化合物类型
2.测定有关理化性质，如不同 pH、不同溶剂中 的溶解度及层析行为，灼烧试验、化学定性反应等。 3.结合文献调研 1.分子式测定可采用下列某种方法： ①元素定量分析＋分子量测定
测定分子式，计算 不饱和度
②同位素峰法 ③HR-MS 2.计算不饱和度 1.官能团定性及定量分析
三、结构研究中采用的主要方法 （一）确定分子式，计算不饱和度 1.元素定量分析＋分子量测定 元素定量分析：确定实验式 如果化合物仅含C、H、O时，通常只作C、H定量，O则由 扣除法求得。
以刺果甘草皂苷元A为例进行说明：
C 79.35%，10.21%，则O=(100-79.35-10.21)％＝10.44% 原子比 C=79.35÷12.01=6.61 10.16 H=10.21÷1.008=10.13 15.58 O=10.44÷16.00=0.65 1 得化合物原子比＝C10H16O1 实验式：C10H16O1 理论值：C：79.29%；H：10.13%；O：10.57% 实测值：C：79.35%；H：10.21%；O：10.44%
已知化合物：
与标准品对照： 共薄层（三种以上系统）：Rf值相同 共熔点 共红外 无标准品：与文献数据对照 mp, IR, UV, MS, 1H NMR, 13CNMR
未知化合物 确定分子式、分子量： 元素分析、质谱、1HNMR、13CNMR谱 功能基、基本骨架和结构式确定： 1、定性反应 2、反应薄层 3、化学反应 3、波谱法
分子中1H的类型，数目及相邻原子或原子团的情况，对有机化
合物的结构测定具有重要的意义。 （1）化学位移：不同类型的1H核磁共振信号将出现在不同的区 域，据此可以进行识别。
类 型
CH －C－CH3 －C－CH2P
δ，ppm
0.8~1.2 1~1.5
－C－CH
R－CH(α)－CH(β) R－CH(α)－CH(β) (R=C=O, C=C, Ar－) ≡CH =CH Ar－H
1. EI-MS：电子轰击质谱 Electron impact ionization
2. CI-MS：化学电离质谱 Chemical ionization
3. FI-MS：场致电离质谱 Field ionization 4. FD-MS：场解析电离质谱 Field desorption ionization