支链氨基酸合成调控机制及菌种选育策略研究进展

支链氨基酸合成调控机制及菌种选育策略研究进展

前言

支链氨基酸（BBCAs）包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，均为必需氨基酸，机体不能自身合成，只能通过食物补充。它们不仅能调节蛋白质的代谢和机体免疫力，还能在机体运动中增加蛋白质的合成，降低肌肉蛋白的分解和损伤，是一类特别重要的营养补充剂，广泛运用于医药、食品及饲料生产等行业。然而，目前国内生产厂家少，产酸水平低，远远不能满足市场的需求，仅配制氨基酸输液每年就需进口上百吨。因此，了解支链氨基酸的生物合成及代谢调控机制，选育生产性能良好的高产菌株极为重要。本文主要介绍了支链氨基酸的生物合成和代谢调节，以及高产菌株选育策略研究进展，为国内相关生产提供参考。

1. 支链氨基酸的生物合成途径

1.1 生物合成方法：发酵法

1.2 主要发酵菌株：

谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum )

黄色短杆菌(brevibacterium flavwn )

乳糖发酵短杆菌(brevibacterium lactofermentum )

大肠杆菌(escherichia coli )

1.3 支链氨基酸生物合成途径

注：图中虚线内表示三种支链氨基酸的合成途径，虚线内大写字母表示相应中间产物的缩写。椭圆型内表示合成过程中相应的关键酶。

图1 支链氨基酸生物合成途径

（1）乙酰羟酸合成酶（AHAS）（α-酮丁酸→α-乙酰-α-羟基丁酸）

有三种同工酶。分别由ilvBN，ilvGM，ilvIH编码。ilvBN高效表达阻碍丙氨酸合成，提高支链氨基酸生成量。有人证明通过将黄色短杆菌ilvBN 基因高效表达，是缬氨酸产量提高了9.85%，同时是丙氨酸和乙酸产量下降了30.49%和20.89%。

（2）二羟基脱水酶（DHAD）（α,β-二羟基-β-甲基戊酸→α-酮-β-甲基戊酸）在谷氨酸棒状杆菌中，该酶受到L-缬氨酸和L-亮氨酸抑制，不过在三种氨基酸都存在的情况下，没有发现协同抑制作用。

（3）乙酰羟酸异构还原酶A（AHAIR）

是支链氨基酸生物合成途径中的第二个共用酶，在催化反应时需要NADPH和金属离子作为辅助因子。它的同工酶与其他酶一样，也存在多种形式。

（4）支链氨基酶转氨酶（TAS）

催化支链氨基酸是其生物合成的最后一步，对氨基酸的合成和相互转化起至关重要的作用。与支链氨基酸合成途径的其他酶不同，转氨酶在动物中也存在，参与支链氨基酸的降解代谢。

2. 支链氨基酸的代谢调控

图2 支链氨基酸生物合成的代谢调节机制

2.1 反馈抑制与反馈阻遏

反馈抑制：是指最终产物抑制作用，即在合成过程中有生物合成途径的终点产物对该途径的酶的活性调节，所引起的抑制作用。

反馈阻遏：即在合成过程中有生物合成途径的终点产物对该途径的一系列酶的量调节,所引起的阻遏作用。反馈阻遏是转录水平的调节,产生效应慢。

反馈抑制与反馈阻遏的区别在于：反馈阻遏是转录水平的调节，产生效应慢，反馈抑制是酶活性水平调节，产生效应快。此外，前者的作用往往会影响催化一系反应的多个酶，而后者往往只对是一系列反应中的第一个酶起作用。

2.2 支链氨基酸代谢调控

(1) 苏氨酸脱氨基酶（TD）

典型的终产物反馈抑制类型，终产物过量合成会抑制该酶活性，导致异亮氨酸合成终止。该酶由ilvA 基因编码，通过敲除ilvA 基因能降低L-异亮氨酸合成，提高L-亮氨酸产量。(2) 乙酰羟酸合成酶（AHAS）

主要受L-缬氨酸的反馈抑制。有时也受到L-亮氨酸及L-异亮氨酸的反馈抑制。将乙酰羟酸合成酶（AHAS）小亚基别构中心的3个氨基酸Gly-Ile-Ile位定点突变成相应的Asp-Asp-Phe，能够完全解除三种支链氨基酸对的AHAS反馈抑制作用。

(3) α-异丙基苹果酸合成酶（IPMS）

α-异丙基苹果酸合成酶（IPMS）受L-亮氨酸的反馈抑制及阻遏，这是亮氨酸合成所特有的关键酶，由lueA基因编码。设法解除亮氨酸对α-异丙基苹果酸合成酶的反馈抑制，并增加α-异丙基苹果酸合成酶的合成量将利于L-亮氨酸的积累。

支链氨基酸合成酶系合成还受三种末端氨基酸的协同反馈阻遏作用。而且，限速酶的活性不仅受目的产物浓度的调节，也受到基质浓度的调节。

3. 支链氨基酸的育种策略

总的看来，工业发酵要想获得较高产量的支链氨基酸产物，必须解除微生物细胞的自我代谢调控机制，最常用且最有效的方法就是从遗传的角度选育解除微生物正常代谢调节机制的突变株。根据支链氨基酸的生物合成途径及代谢调节机制，选育的基本途径主要有以下几种。3.1 诱变育种

诱变策略：诱变育种技术操作简单，技术要求低，仍是目前较常用的菌株改良方法。支链氨基酸是初级代谢的主要产物，他们的生物合成是由反馈抑制和反馈阻遏的调节机制所控制，因此在诱变育种过程中，可以通过选育营养缺陷型来切断支路代谢。使代谢流朝向我们所需的目的产物进行。

图3 诱变育种示意图

有文献表明：诱变后的金黄色葡萄球菌BM2610比野生型BF420异亮氨酸的产量提高了

122.5%。

3.2 代谢工程育种

图4 代谢工程育种

（1）全面分析细胞的代谢网络结构；

（2）找出关键节点；

（3）采用特定的手段对局部代谢途径进行改造；

（4）通过基因敲除敲除竞争途径减少副产物产生改变细胞的代谢网络及代谢通量分布。

3.3 基因组改组

基因组改组技术是将诱变育种与原生质体融合技术相结合的一种有效手段，通过对多个正突变体递推式融合使基因组随机重组，快速筛选所需目的性状有显著改进的重组体。它将改组的对象从单个基因扩展到整个基因组，因而能扩大变异范围，提高菌株的进化速率，增加获得高产突变株的机会，为快速开发和利用微生物资源提供了一条捷径。

基因组改组的实质是：诱变育种和原生质体融合的联合利用。

图5 基因组改组

3.4 全局转录机器工程育种

(1) 原理：相同的RNA聚合酶负责细胞内所有基因转录过程的起始、延伸和终止，RNA聚合酶