荧光显微镜

方法
1.质粒DNA的提取,方法略。 2.基因电转移 a.采集产出后1.0～1.5 h内的新鲜家蝇卵，加入少量TE ，使卵在载玻片上分散并计数。每100枚卵为一个单位 ，放入反应杯内，再加入95 ul TE、pBac[DsRed]和 helper质粒各5 ul（200 ng/ul），按脉冲电压1500 v和 脉冲时间5.4 ms进行电转移。将经电转移处理的卵取出 ，放入新鲜配置的幼虫饲料（麸皮加水）中，于25～ 27℃条件下进行培养。 b.将培养3～4天的幼虫在倒置荧光显微镜下观察，凡眼 部和神经脊索呈现特异红色荧光的为转基因阳性（为了 防止幼虫的爬行而影响实验的进行，可以先把家蝇幼虫 放在冰上一段时间后再观察）。
荧光显微镜就其光路来分有两种： 荧光显微镜就其光路来分有两种 1．透射式荧光显微镜：激发光源是通过聚光镜穿过标 本材料来激发荧光的。这是比较旧式的荧光显微镜。其 优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧 光减弱． 2．落射式荧光显微镜：这是近代发展起来的新式荧光 显微镜，与上不同处是激发光从物镜向下落射到标本表 面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。 光路中需加上一个双色束分离器，它与光铀呈45度角， 激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生 的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光 同时进入物镜，反回到双色束分离器，使激发光和荧光 分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。此种荧光显微镜 的优点是视野照明均匀，成像清晰，Hale Waihona Puke Baidu大倍数愈大荧光 愈强。
荧光显微镜在各领域的应用 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照 射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光 ，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外 线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质 进行定性和定量研究的工具之一。荧光显微镜在 各领域中的应用都非常广泛。
(1) 荧光显微镜的应用包括一般荧光染色和免疫 荧光染色方法,荧光染色方法可以显示细胞内的 各种成份, 特别是对细胞内的两种核酸(DNA 或 RNA) 及酸性粘多糖有较强的特异性,所以荧光染 色法可以作为一种良好的细胞化学方法。免疫荧 光方法是把免疫学技术和荧光染色结合起来一种 方法,它具有免疫学的特异性和荧光方法的敏感 性,作为一种研究方法或实验手段,广泛地应用于 医学领域内各种基础理论研究和临床诊断,如组 织细胞学,微生物学,寄生虫学,病理学的研究以及 自身免疫病诊断。
采用荧光显微镜技术,可以观察桔梗花粉管 自花授粉、自株花授粉、异花授粉下花粉粒的萌 发生长,以及柱头内外授粉花粉粒的萌发情况。 现在在植物细胞凋亡机理的研究中对线粒体进行 染色后,用荧光显微镜能够很清晰地观察到活细 胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光;凋亡细胞核 染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈 泡状膨出及凋亡小体。 利用荧光标记技术显示微管,可以在多种植物 生殖细胞内清楚地看到微管骨架的存在。在植物 细胞的观察研究中,通过染色可以更清晰地观测 到细胞的形态及结构。在实验中发现,荧光显微 镜还可以直接(不做任何处理)观察植物叶的气孔 器,而且能观察到气孔的变化情况,为荧光显微镜 找到了一种新用途。
20 世纪30 年代荧光染色即已用于细菌、霉 菌等微生物及细胞、纤维等的形态观察和研究。 如用抗酸菌荧光染色法可帮助人们在痰中找到结 核杆菌。40 年代创造了荧光染料标记蛋白质的 技术,这种技术现已广泛应用于免疫荧光抗体染 色的常规技术中,可检查和定位病毒、细菌、霉 菌、原虫、寄生虫及动物和人的组织抗原与抗体 ,可用以探讨病因及发病机理,如肾小球疾病的分 类及诊断,乳头瘤病毒与子宫颈癌的关系等。
由于某些原因，目前还没有发现转基因成功的家蝇，如果 转化成功，会有类似于以下的结果。
荧光显微镜下的按蚊幼虫 上方的幼虫为DsRed 阳性, 可见其眼部和神经索部位有特异的 红色荧光; 下方的为阴性对照
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左图是哥伦比亚大学的简·施莫兰泽(Jan Sch-moranzer)，在经过 血清饥饿处理的成纤维细胞的受创细胞膜上，拍摄到的微管结 构图(绿色)。从图上看来，成纤维细胞的微管已经表现出异常行 为。微管的直径约20nm，通常情况下，当细胞膜上有裂口时， 微管会向裂口处聚集，但图中反映的情况却不是这样。在细胞 分裂间期，杜克大学的U·塞尔达尔·图卢(U. Serdar Tulu)在138µm 宽的视野中，拍摄到了染色体(蓝色)周围正在形成的微管(黄色 ，右图)。
(2)荧光显微镜在动物研究方面的研究也非常广泛 。利用动物蛋白质对光的选择吸收特性，科学家 早已发明了用荧光显微镜观测活体动物内部器官 组织和活细胞的技术，但光在动物内部组织的聚 焦性能太弱，使显微镜下的图像变得非常模糊， 因此这项技术一直局限于研究表层厚度不超过1 毫米的活体 。 通过荧光显微镜技术，科学家还可以对生物 分子进行光学标注，研究在纳米尺度内的分子图 像。研究人员利用这种方法可以减少荧光着色活 体组织的背景干扰信号，未来不仅可以研究其它 脊椎动物的细胞功能，还可用于开发直接针对动 物器官和组织的新药。
荧光显微镜的使用方法 1．打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮 点。 2．透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要 求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的阻断滤片。落 射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤 片／双色束分离器／阻断滤片的插块。 3．用低倍镜观察，根据不同型号荧光显微镜的调节装 置，调整光源中心，使其位于整个照明光斑的中央。 4．放置标本片，调焦后即可观察。 使用中应注意：未 装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤；用油 镜观察标本时，必须用无荧光的特殊油镜；高压汞灯关 闭后不能立即重新打开，需经5分钟后才能再启动，否 则会不稳定，影响汞灯寿命。 5．观察。
荧光显微镜更广泛用于免疫细胞化学研究， 即以异硫氰酸或罗丹明等荧光素标记抗体（一抗 或二抗），用该标记抗体直接或间接地与细胞内 的相应抗原结合，以检测该抗原的存在与分布。 另外，根据荧光蛋白的特性，荧光显微镜还可用 于转基因方面的研究，是荧光观察的有利工具。
应用实例 荧光显微镜在转基因方面的应用 根据转座子piggybac（PB）在哺乳动物中 的转座能力，而且携带着许多个基因的PB元素 在人类和老鼠的细胞系中可以有效的转置，PB 允许它携带的标记基因的表达。 我们将带有转座子、标记基因红色荧光蛋白 基因的供体质粒pBac[DsRed]和带有转座酶的辅 助质粒helper通过电转化的方法转入家蝇新产卵 （1.0～1.5 h内）中进行实验研究。
(2) 荧光显微镜在植物研究中的应用也非常广泛 。利用某些物质在短光波照射下即可发生荧光的 特性,对植物细胞用荧光显微镜进行观察研究。 如细胞内大部分脂质和蛋白质经照射均可发出淡 蓝色荧光,而叶绿体发出火红色荧光。但大部分 物质仍需要用荧光染料(如吖啶橙、异硫氰酸荧 光素等) 染色后,在短光波照射下才能发出荧光。
荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源 ，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光 3650入或紫蓝光4200入)作为激发光、激发标本 内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再 通过物镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的 对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性 高。主要用于细胞结构和功能、细胞内物质的吸 收、运输、化学物质的分布及定位以及化学成分 等的研究。