糖类药物制备原理

• 2.分级沉淀法 • 不同多糖在不同浓度的甲醇、乙醇或丙酮中的溶解度不 同，因此可用不同浓度的有机溶剂分级沉淀分子大小不同的 粘多糖。在Ca2+、Zn2+等二价金属离子的存在下，采用乙醇 分级分离粘多糖可以获得最佳效果。 • 3.季胺盐络合法 • 粘多糖与一些阳离子表面活性剂如十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)和十六烷基氯化吡啶(CPC)等能形成季胺盐络合物。 这些络合物在低离子强度的水溶液中不溶解，在离子强度大 时，这种络合物可以解离，溶解，释放。使其溶解度发生明 显改变时的无机盐浓度(临界盐浓度)主要取决于聚阴离子的 电荷密度。粘多糖的硫酸化程度影响其电荷密度，根据其临 界盐浓度的差异可以将粘多糖分为若干组(表8-1)。 • 降低pH可抑制羧基的电离，有利于增强硫酸粘多糖的选择 性沉淀。季胺盐的沉淀能力受其烷基链中的“-CH2-”基数的 影响，还可以用不同种季胺盐的混合物作为酸性粘多糖的分 离沉淀剂如Cetavlon和Arguad l6等(季胺盐混合物的商品名)。 • 应用季胺盐沉淀多糖是分级分离复杂粘多糖与从稀溶液中 回收粘多糖的最有用方法之一。
• (2)酶解法 • 蛋白酶水解法已逐步取代碱提取法而成为提取多糖的最 常用方法。理想的工具酶是专一性低的、具有广泛水解作用 的蛋白酶。鉴于蛋白酶不能断裂糖肽键及其附近的肽键，因 此成品中会保留较长的肽段。为除去长肽段，常可与碱解法 合用。酶解时要防止细菌生长，可加甲苯、氯仿、酚或叠氮 化钠作抑菌剂，常用的酶制剂有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和链 霉菌蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶。酶解液中的杂蛋白可用三氯 醋酸法，磷钼酸—磷钨酸沉淀法，高岭土吸附法、三氟三氯 乙烷法，等电点法去除，再经透析后，用乙醇沉淀即可制得 粗晶粘多糖。 • (二)多糖的纯化 • 多糖的纯化方法很多，但必须根据目的物的性质及条件 选择合适的纯化方法。而且往往用一种方法不易得到理想的 结果，因此必要时应考虑合用几种方法。
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一般组织中存在多种粘多糖。纯化时，需要对粘多糖进 行分离纯化。可利用各种粘多糖在乙醇中溶解度的不同，以 乙醇分级沉淀法进行纯化分离；或利用粘多糖聚阴离子电荷 密度的不同，用季胺盐络合物法，阴离子交换层析法和电泳 法进行分离，纯化。 • (1)碱解法 • 多糖与蛋白质结合的糖肽键对碱不稳定，故可用碱解法 使糖与蛋白质分开。碱处理时，可将组织在40℃以下，用 0.5mol/L NaOH溶液提取，提取液以酸中和，透析后，以高 岭土、硅酸铝或其他吸附剂除去杂蛋白，再用酒精沉淀多糖。 粘多糖分子上的硫酸基一般对碱较稳定，但若硫酸基与邻羟 基处于反式结构或硫酸基在C-3或C-6，此时易发生脱硫作用。 如肝素、硫酸乙酰肝素的氨基葡萄糖C-6上有硫酸基，C-3上 可为游离羟基或硫酸基。另外，肝素或硫酸皮肤素分子上的 艾杜糖醛酸C-2上有时含硫酸基，而C-3上有羟基与之成反式 结构，因此对这类多糖不宜用碱解法提取。
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(二)糖类药物的生理活性 1.调节免疫功能。主要表现为影响补体活性，促进淋巴 细胞增殖，激活或提高吞噬细胞的功能。增强机体的抗炎、 抗氧化和抗衰老作用。 2.抗感染作用。多糖可以提高机体组织细胞对细菌，原 虫，病毒和真菌感染的抵抗力。如甲壳素对皮下肿胀有治 疗作用，对皮肤伤口有愈合作用。 3.促进细胞DNA，蛋白质的合成，促进细胞的增殖、生 长。 4.抗辐射损伤作用，茯苓多糖、紫菜多糖、透明质酸、 甲壳素等均能抗60C。-γ射线的损伤，有抗氧化、防辐射作 用。 5.抗凝血作用。肝素是天然抗凝剂。甲壳素、芦荟多糖、 黑木耳多糖等也具有肝素样的抗凝血作用。 6.降血脂，抗动脉粥样硬化作用。类肝素(heparinoid)硫酸 软骨素、小分子量肝素等具有降血脂、降血胆固醇，抗动 脉粥样硬化作用，用于防治冠心病和动脉硬化。
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(二)生产工艺
甘露醇在海藻、海带中含量较高。海藻洗涤液和海带洗 涤液中甘露醇的含量分别为2%与1.5%，是提取甘露醇的重 要资源。以葡萄糖为原料，经电解、脱盐、精制即可制得， 电解转化率为98~99.6%，也可以用发醇法生产。 • 1.提取法 • 工艺路线：
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二、多糖的分离与纯化 多糖可来自动物、植物和微生物。来源不同，提取分离方 法也不同。植物体内含有水解多糖衍生物的酶，必须抑制或 破坏酶的作用后，才能制取天然存在形式的多糖。供提取多 糖的材料必须新鲜或及时干燥保存，不宜久受高温，以免破 坏其原有形式，或因温度升高，使多糖受到内原酶的作用。 速冻冷藏是保存提取多糖材料的有效方法。 • 提取方法依照不同种类的多糖的溶解性质而定。如昆布 多糖、果聚糖、糖原易溶于水；壳多糖与纤维素溶于浓酸； 直链淀粉易溶于稀碱；酸性粘多糖常含有氨基已糖、已糖醛 酸以及硫酸基等多种结构成分，且常与蛋白质结合在一起， 提取分离时，通常先用蛋白酶或浓碱、浓中性盐解离蛋白质 与糖的结合键后，用水提取，再将水提取液减压浓缩，以乙 醇或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀酸性多糖，最后用 离子交换色谱进一步纯化。 • (一)多糖的提取 • 提取多糖时，一般先需进行脱脂，以便多糖释放。方法 是将材料粉碎，用甲醇或1：1乙醇乙醚混合液，加热搅拌 1~3h，也可用石油醚脱脂。动物材料可用丙酮脱脂、脱水处 理。
第二节 糖类药物生产工艺
• 糖类药物品种繁多，发展迅速，现根据其来源、性质及工 艺特点不同，主要介绍具有代表性的几个重要品种的生产 工艺。 • 一、D-甘露醇(D-Mannitol)的制备。
• (一)结构与性质
• 甘露醇又名己六醇。
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甘露醇为白色针状结晶，无臭，略有甜味，不潮解。易 溶于水(15.6g 18℃)溶于热乙醇，微溶于低级醇类和低级胺 类，微溶于吡啶，不溶于有机溶剂。在无菌溶液中较稳定， 不易为空气所氧化。溶点166℃，[α]20D+28.6°(硼砂溶液)。
• 三、糖类药物的作用 • (一)糖类药物的种类及来源 • 1.单糖如葡萄糖、果糖、氨基葡萄糖和维生素C等。 • 2.低聚糖如蔗糖、麦芽糖乳糖、乳果糖(Lactulose)等。 • 3.多糖如右旋糖酐、甘露聚糖、香菇多糖、茯苓多糖等。 • 4.糖的衍生物如6-磷酸葡萄糖，1，6-二磷酸果糖，磷酸 肌醇等。 • 糖类药物研究最多的是多糖类药物，已发现具有一定生 理活性的多糖有来源于植物的黄芪多糖、人参多糖、刺五加 多糖、麦麸多糖、黄精多糖、昆布多糖、菊糖、褐藻多糖、 薄叶大黄多糖、茶叶脂够糖、葡萄皮脂多糖、麦秸半纤维素 B、针裂蹄多糖、酸模多糖、地衣多糖。来源于微生物的多 糖有猪苓多糖、银耳多糖、香菇多糖、灵芝多糖、黑木耳多 糖、云芝多糖、茯苓多糖、竹黄多糖、木蹄多糖、蘑菇多糖、 裂褶多糖、亮菌多糖、酵母多糖、细菌脂多糖、大肠杆菌脂 多糖、变形杆菌热窄多糖、NK131细菌多糖和产氨短杆菌 外多糖。来源于动物的多糖有 肝素、硫酸乙酰刮素、硫酸 软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、透明质酸、壳多糖和胎 盘脂多糖。
• 4.离子交换层析法 • 粘多糖由于具有酸性基团如糖醛酸和各种硫酸基， 在溶液中以聚阴离子形式存在，因而可用阴离子交 换剂进行交换吸附。常用的阴离子交换剂有D254， Dowex-X2，ECTEOIA-纤维素，DEAE-C，DEAESephadex A-25和Deacidite FF。吸附时可以使用 低盐浓度样液，洗脱时可以逐步提高盐浓度如梯度 洗脱或分步阶梯洗脱。以DowexⅠ进行分离时，分 别有0.5，1.25，1.5，2.0和3.0mol/L NaCl洗脱，可 以分离透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、肝 素和硫酸角质素。以DEAE-sephadex A-25层析时， 分别用0.5，1.25，1.5和2.0mol/L NaCl洗脱，可以 依次分离透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和 硫酸皮肤素与硫酸角质素和肝素。 • 此外，区带电泳法、超滤法及金属络合法等在多 糖的分离纯化中也常采用。如应用区带电泳法可分 离透明质酸、硫酸软骨素与肝素等。
• 1.乙醇沉淀法 • 乙醇沉淀法是制备粘多糖的最常用后段。乙醇的加入， 改变了溶液的极性，导致糖溶解度下降。供乙醇沉淀的多 糖溶液，其含多糖的浓度以1~2%为佳。如使用充分过量的 乙醇，粘多糖浓度少于0.1%也可以沉淀完全。向溶液中加 入一定浓度的盐，如醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵或氯化钠有 助于使粘多糖从溶液中析出，盐的最终浓度5%即足够。使 用醋酸盐的优点是在乙醇中其溶解度更大，即使在乙醇过 量时，也不会发生这类盐的共沉淀。一般只要粘多糖浓度 不太低，并有足够的盐存在，加人4~5倍乙醇后，粘多糖可 完全沉淀。可以使用多次乙醇沉淀法使多糖脱盐，也可以 用超滤法或分子筛法(Sephadex G-10或G-15)进行多糖脱 盐。加完酒精，搅拌数小时，以保证多糖完全沉淀。沉淀 物可用无水乙醇、丙酮、乙醚脱水，真空干燥，即可得疏 松粉末状产品。
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多糖是非细胞毒物质，在细胞内的存在方式有游离型与结 合型两种。结合型多糖有与蛋白质结合在一起的糖蛋白和与 脂类结合在一起的脂多糖。前者如黄芪多糖、人参多糖和刺 五加多糖，后者如胎盘脂多糖和细菌脂多糖。糖基在糖蛋白 分子中的作用有的与生理活性有关，有的与抗原性有关，还 有的与细胞“识别”功能有关。 • 一、单糖及其衍生物的制备 • 游离单糖及小分子寡糖易溶于冷水及温乙醇，如葡萄糖、 果糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、双糖类如蔗糖、麦芽糖， 三糖类如棉籽糖、龙胆糖，四糖类如来苏糖，以及多元醇类， 如卫矛醇、甘露醇等 • 可以用水或在中性条件下以50%乙醇为提取溶剂，也可以 用82%乙醇，在70~78℃下回流提取。溶剂用量一般为材料 的20倍，需多次提取。植物材料磨碎经乙醚或石油醚脱脂， 拌加碳酸钙，以50%乙醇温浸，浸液合并，于40~45℃减压 浓缩至适当体积，用中性醋酸铅去杂蛋白及其他杂质，铅离 子可用H2S除去，再浓缩至粘稠状。以甲醇或乙醇温浸，去 除不溶物如无机盐或残留蛋白质等。醇液经活性炭脱色、浓 缩、冷却、滴加乙醚，或置于硫酸干燥器中旋转，析出结晶。 单糖或小分子寡糖也可以在提取后，用吸附层析法或离子交 换法进行纯化。
• 多糖的提取方法主要有以下几种。 • 1.难溶于冷水、热水，可溶于稀碱液者 • 这一类多糖主要是不溶性胶类，如木聚糖、半乳聚糖等。 用冷水浸润材料后用0.5mol/L NaOH提取，提取液用盐酸中 和、浓缩后，加乙醇沉淀得多糖。如在稀碱中仍不易溶出者， 可加入硼砂，对甘露聚糖、半乳聚糖等能形成硼酸络合物的 多糖，此法可得相当纯的物质。 • 2.易溶于温水、难溶于冷水和乙醇者 • 材料用冷水浸过，用热水提取，必要时可加热至80~90℃ 搅拌提取，提取液用正丁醇与氯仿混合液除去杂蛋白(或用 三氯乙酸除杂蛋白)，离心除去杂蛋白后的清液，透析后用 乙醇沉淀得多糖。 • 3.粘多糖 • 有些粘多糖可用水或盐溶液直接提取，但因大部分粘多糖 与蛋白质结合于细胞中，因此需用酶解法或碱解法使糖—蛋 白质问的结合键断裂，促使多糖释放。碱解法可以防止粘多 糖分子中硫酸基的水解破坏，也可以同时用酶解法处理组织。 提取液中的残留蛋白可以用蛋白质沉淀剂或吸附剂如硫酸铝、 藻土等除去。
糖类药物制备原理
第一节 概
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述
糖类广布于生物体中，可分为单糖、低聚糖和多糖，已发 现不少糖类物质及其衍生物具有很高药用价值，有些已在临 床广泛应用。 • 多糖类药物近来很引人注目，尤其在抗凝、降血脂、提高 机体免疫和抗肿瘤、抗辐射方面都具有显著药理作用与疗效。 • 如PS-K多糖和香菇多糖对小鼠S180瘤株有明显抑制作用，已 作为免疫型抗肿瘤药物，猪苓多糖能促进抗体的形成，是一 种良好免疫调节剂，还有茯苓多糖、云芝多糖、银耳多糖、 胎盘脂多糖等都已在临床上应用。肝素是天然抗凝剂，用于 防治血栓、周围血管病、心绞痛、充血性心力衰竭与肿瘤的 辅助治疗。硫酸软骨素有利尿、解毒、镇痛作用。右旋糖酐 可以代替血浆蛋白以维持血液渗透压，中分子量右旋糖酐用 于增加血容量，维持血压，以抗休克为主；低分子量右旋糖 酐主要用于改善微循环，降低血液粘度；小分子量右旋糖酐 是一种安全有效的血浆扩充剂。海藻酸钠能增加血容量，使 血压恢复正常。 •