酶联免疫吸附测定法

酶联免疫吸附测定法（ELISA）

1.定义 (3)

2.原理 (3)

2.1抗原抗体反应 (3)

2.2免疫测定在临床检验中的应用 (5)

3.ELISA的类型 (5)

3.1双抗体夹心法测抗原： (6)

3.2双抗原夹心法测抗体 (6)

3.3间接法测抗体 (6)

3.4竞争法测抗体 (7)

3.5竞争性测抗原 (7)

3.6捕获包被法测抗体 (7)

3.7ABS-ELISA法 (8)

4.ELISA试剂的组成 (9)

4.1固相载体： (9)

4.2包被的方式 (9)

4.3包被用抗原：天然抗原、重组抗原、合成多肽抗原。 (10)

4.4包被的条件： (10)

4.5洗涤液： (10)

4.7酶的催化性； (11)

4.8结合物的制备 (11)

4.9结合物的保存 (12)

4.10酶的底物 (12)

4.11酶反应终止液 (12)

4.12参考标准品 (13)

4.13加样： (13)

4.14保温 (13)

4.15保温方式： (13)

4.16室温温育的反应 (13)

4.17洗涤 (14)

4.18显色 (14)

4.19比色 (14)

4.20酶标比色仪 (15)

4.21结果判定 (15)

4.22定量测定 (16)

4.23ELISA的操作要点 (16)

1.定义

酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。

2.原理

采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，可对受检物质的定性或定量分析。

2.1抗原抗体反应

2.1.1可逆性

抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：

Ag+Ab→Ag·Ab

抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原和抗体均能保持原有的结构和活性。

2.1.2特异性

抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。因此，在很多时候，测定某一特定的物质不需分离待测物。2.1.3最适比例

只有当抗原抗体的浓度比例是当时，才出现可见反应。

以沉淀反应为例（Ab量固定，Ag量递增）

图（1）

该理论的支持者网格学说，其成立的三个条件：

➢抗原多价，抗体双价；

➢二则比例合适；

➢Ag/Ab过剩。

当抗原抗体浓度比例合适时，抗体的两个Fab段分别结合两个Ag分子，相互交叉结合连接成巨大的网格状立体聚合物，沉淀可见，如图b。

Ab/Ag过剩时，过剩方的结合价得不到饱和，大多数游离存在，只形成小分子复合物，沉淀不可见，如图a，c，d。

图（2）

2.1.4敏感性

化学比色法的敏感度为mg/mL水平；酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/mL；免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应相仿；标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/mL水平。如HBsAg，其敏感度可达0.1ng/mL。

2.2免疫测定在临床检验中的应用

由于各种抗原成分，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可测试标本中的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。

3.ELISA的类型

ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：➢免疫吸附剂：固相的抗原或抗体；

➢结合物：酶标记的抗原或抗体；

➢底物：酶催化的此物。

常见的检测方法有：双抗体夹心测抗原、

3.1双抗体夹心法测抗原：

图（3）

此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可以用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。

3.2双抗原夹心法测抗体

用特异性抗原进行包被和制备酶标结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。

3.3间接法测抗体

间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。

3.4竞争法测抗体

图（4）

当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。

3.5竞争性测抗原

小分子抗原或半抗原缺乏可作为夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中的抗原含量越多，结合在固相上的酶标抗原越少，最后显色也越浅。小分子激素、药物等多用此法。

3.6捕获包被法测抗体

以IgM抗体为例。血清中针对某些抗原的特异性IgM常和非特异性IgM，以及特异性IgG 同时存在，后者会干扰IgM的测定。捕获法则较好地解决了上述问题，其原理是先用抗人IgM（μ链）抗体包被固相载体，使血清中所有IgM(包括特异性与非特异性IgM)均固定在固相上，经洗涤去除IgG后，再测定特异性IgM。此方法目前主要用于检测各类早期感染的特异性抗体IgM。

3.7ABS-ELISA法

ABS为亲和素（avidin）生物素（biotin）系统（system）的略语。亲和素是一种糖蛋白，分子量60000，每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物，分子量244。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与4个生物素分子结合，因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素