样品预处理

样品预处理过程中 的主要故障与解决办法
出现无关峰, 可能是样品过滤器带来污染
将过滤器浸泡在样品溶剂中并进样试验 改变过滤器类型 采用交替清洗技术
部分或全部的峰比预期的小,尤其是低浓度, 可能是样品过 滤器表面吸附
改变过滤器类型 严格按相同条件处理所用样品 采用交替清洗技术。
回收率太低, 可能是萃取不完全,
第十一章 流动相及样品的预处理
主要内容 液相色谱对流动相的要求 流动相的脱气 样品的预处理
目的 重要性 常用方法 新方法
液相色谱对流动相的要求
除色谱柱对流动相对的要求外，还有∶
与检测器匹配 脱气 避免卤素离子（不锈钢系统） 溶剂的粘度 细菌的生长
流动相的脱气
流动相脱气的目的
使色谱泵的输液准确
强酸
三氯乙酸，过氯酸
盐
50% 硫酸铵 10% TCA
样品衍生
提高检测的灵敏度
增加紫外基团以增强紫外检测的灵敏度 增加荧光基团使样品用高灵敏度荧光检测器
改变分离的选择性
改变组份的基团，如：
变离子型化合物为非离子型，用反相方法分离
典型的例子
氨基酸分析
浓缩样品
浓缩样品的方法
萃取/吹干 沉淀/再溶解 色谱法 液固抽提/SPE小柱
固相萃取（SPE）技术
固相萃取：是基于同液相色谱同样技术开发的产品，分离 复杂样品中的不同组份
固相萃取（SPE）的重要性
实验室中60~80%的成本及工作量在 样品制备上
加速样品的制备时间 降低样品前处理的成本 提高分析的准确性及回收率 更容易自动化 减少样品处理步骤 降低对不稳定样品的影响 提高安全性
增加萃取时间,使用热溶剂 修改清洗方法。
色谱峰变宽,柱寿命缩短, 可能是样品带来的干扰与污染,改 进清洗方法。 精度差, 可能是回收不完全
改进或替换衍生化、分离、萃取或其他条件 用自动化处理装置提高精度。
输液均匀准确，并且脉动减小 保留时间及色谱峰面积的重现性提高
提高检测的性能
防止气泡引起的尖峰 基线稳定，信噪比增加 溶剂的紫外吸收本底降低
保护色谱柱
减少死体积 防止填料的氧化
流动相脱气的方法
加热
简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组 成的变化
抽真空
同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果
让所感兴趣的样品通过小柱，杂质留在柱上 让杂质留在柱上，所感兴趣的样品通过小柱
各种SPE小柱（一）
正相
包括∶Silica / Florisil / NH2 / Diol / CN / Alumina
可先用6到10倍柱体积的非极性（通常是样品溶液）平衡 加入样品 用非极性溶剂洗脱不想要的组份 用极性溶剂洗脱第一组感兴趣的组份 用极性更强的溶剂洗脱剩下的感兴趣的组份
超声波
简单，但效果不理想。
通惰性气体（一般用氦气）
可保持连续脱气，多用于低压梯度
脱气机
可保持连续脱气，多用于低压梯度
样品的预处理
样品预处理的目的
除去微粒 减少干扰杂质 浓缩微量的组份 提高检测的灵敏度及选择性 改善分离的效果 有利于色谱柱及仪器的保护
样品的预处理重要性
占样品分析时间的比例
样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间
溶剂A 溶剂B 乙醇 水
1
2
3
葡萄 Kool-Aid
糖
红色 染料
蓝色 染料
洗脱次序
用SPE C18富集
在分析前浓缩产物到ppm 或ppb级 步骤∶
小柱先要用甲醇活化，然后 用水平衡。 把大量(几百毫升)样品载入 小柱 溶剂流出 被分析的组份仍保留在柱子 内 最后用少量(几毫升)非极性 溶剂洗出极性较弱的要分析 的组份
SPE小柱
许多品牌专门开发了固相萃取技（SPE） SPE小柱的应用领域
除去杂质及干扰组份 把样品分成不同极性的组分析 富集微量的组份
SPE小柱的主要种类
反相 正相 离子交换
SPE的种类
反 固定相 溶 剂 相 正 相 离子交换
带电荷 非极性 极性
从极性 从非极性 pH或离子强 到非极性 到极性 度(低到高) 根据SPE及样品的性质，选洗脱强度不同的溶剂把样品分 开 让样品的各组份在固定相上吸附、解吸附，或不与固定相 作用
Hale Waihona Puke Baidu
溶液
色谱分析
预处理中的污染
环境污染
仪器室的有害气体、气溶液、灰尘等等都能造成污染, 影响检测结果
容器
容器的清洁是取得好的检测结果的基本保证
试剂
含有杂质, 会出现杂峰而影响测定结果, 使用高纯度试剂
标准溶液的配置
标准物质应当纯度高、性质稳定 常用的标准溶液应低温保存 配制维生素类标准品时,要放置在棕 色容量瓶中或避光放置以免分解
用SPE C18除去杂质
使极性的杂质先流出 中等极性样品流出，保留 并分析 小柱及其非极性杂质丢弃 举例：多肽混合物脱盐
小柱先要用甲醇活化，然后 用水平衡。 把样品载入小柱 盐等极性物先流出。 用更强 ( 极性更弱 ) 的流动相 洗出极性较弱的多肽
多肽杂质的去除
活化
脱盐
多肽
洗脱次序
用SPE C18分组分析
占分析的消耗总成本最大
消耗大量的溶剂及其他化学品
实验的重复性及准确性最差的环节
影响实验结果好坏的最重要因素
是决定性的步骤
样品预处理常用的方法
高速离心 过滤、超滤 选择性沉淀 衍生反应 液-固萃取 / 液-液萃取
Sep-Pak样品处理小柱
其他
去除微粒
过滤
过滤膜/过滤装置
有机(0.45m)/无机(0.45µm) 膜片可更换
一次性使用的膜“Cartridge”
使用方便简单，交叉污染小 有更小内径，可用于微量样品的处理
高速离心
大于：10,000g
超滤
机理
超滤是一种基于分子量分离的技术
目的
根据分子量的不同把分子、细胞及病毒等分为 不同的馏份 除去小分子样品中的大分子蛋白 脱盐
选择性沉淀
常用于生化样品中除蛋白
有机溶剂
乙腈，甲醇
确认回收率
SPE小柱的方法开发
SPE方法开发的几个关键因素
文献查阅
专门SPE应用资料的数据库
流速控制
同色谱理论：以10ml/min润湿小柱，1~5ml/min加载样品 离子交换填料或固定相少于100mg的小柱，用更低的流速加载 样品 以1~5ml/min流速洗脱样品
注意样品本底的不同 注意载荷量及加样方式
富集/浓缩
1. 甲醇 2. 水 样品保留 在柱头上 强溶剂
大量样品
活化/平衡 溶剂流出 浓缩样品
预处理新技术（部分）
固体样品 样品 制备 自动索氏提取 (AutoSox) 加速溶剂萃取 (ASE) 微波辅助溶剂萃取 (MASE) 超临界流体萃取 (SFE) 固相萃取 (SPE) 固态介质 固相微萃取 (SPME) 预 处理 支持液膜萃取 (SLME) 微孔膜液液萃取 (MMLLE) 液态介质 液相微萃取 (LPME) 电萃取 (EE) 逆流萃取 (CCD) 气态介质 膜萃取 (ME)
在不同条件下，有些填料可以用于反相或离子交换， 如∶NH2 / CN 确认回收率
各种SPE小柱（二）
反相
包括∶C18 / C8 / Diol / NH2 / CN
可先用6到10倍柱体积的甲醇或乙腈活化，再用6到10倍 柱体积的水或缓冲液平衡，不要让小柱干了 样品溶解在强一些极性的溶剂中 加入样品 用强极性溶剂洗脱不想要的组份 用极性弱些的溶剂洗脱第一组感兴趣的组份 用极性更弱的溶剂洗脱剩下的感兴趣的组份
样 品 是 一 种 叫 作 “ KoolAid ”葡萄饮料的混合物 步骤∶
小柱先要用甲醇活化，然后 用水平衡。 把样品载入小柱 糖、有机酸等极性物质先流 出。 用乙醇 / 水混合物洗出中等 极性的红色染料 蓝色染料仍留在柱子内 最后用100%乙醇洗出极性最 弱的蓝色染料
Kool-Aid(一种饮料)的分析