碱性蛋白酶菌株的筛选及产酶条件初探
碱性蛋白酶的分离纯化与性质初探

碱性蛋白酶的分离纯化与性质初探一、综述本课题国内外研究动态,说明选题的依据和意义:1.国内外研究现状碱性蛋白酶(Alkaline protease)广泛存在于微生物中,最早发现在猪的胰脏中,1913年Rhom首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用。
1945年瑞士的Dr.Jagg 等发现了微生物碱性蛋白酶,使其成为洗涤剂的主要添加剂之一。
碱性蛋白酶在丝绸、制革工业、饲料工业、动物食品加工中也有广泛用途。
由于市场的需求,高产、高效、耐高温、耐高碱的四高型碱性蛋白酶成为国内外当前研究的热点之一[1]。
研究结果发现,海洋酶具有作用pH 范围宽,最适pH 和反应温度适中,随反应温度的降低酶活性下降缓慢等特点。
海洋酶所具有的独特性质,引起学术界高度重视,日、美等国就此展开了深入的研究。
迄今为止,由海洋微生物生产海洋酶的专利已达20 余项。
海洋微生物酶的研究正逐渐成为发达国家开发新型酶制剂的重要途径[2,3]。
相比之下,国内在海洋碱性蛋白酶研究方面差距较大。
综合多篇文献分析,目前针对海洋细菌产生的碱性蛋白酶,分离提纯的方法大致多采用饱和硫酸铵分级盐析和层级技术。
首先是从发酵液取上清制备粗酶液(此酶为一种外分泌蛋白,无需通过溶菌酶溶解或超声波破碎细胞来制备粗酶液),通过超速离心沉淀,饱和硫酸铵分级盐析,透析,凝胶层析或离子交换层析来分离提纯该菌所产生的碱性蛋白酶。
其中一些已经对酶的性质、序列等进行了研究[4-7]。
2.选题依据及意义此毕业设计的课题为《碱性蛋白酶的分离纯化及性质初探》,主要是对海洋细菌进行培养及分离提纯方案的改进,并对其性质进行初步探究。
大致是将各种相关参数和实验数据建立正交关系得到最佳培养条件,并对其产生的碱性蛋白酶进行分离提纯,同时得出最佳分离提纯方案。
最后对碱性蛋白酶的性质进行初步研究。
本设计针对目前研究较少的产碱性蛋白酶的海洋微生物新菌株,研发新型高效的碱性蛋白酶,这对满足人类生活、生产与技术开发的需求至关重要。
高产碱性蛋白酶菌株的筛选及酶学性质的研究

高产碱性蛋白酶菌株的筛选及酶学性质的研究高产碱性蛋白酶菌株的筛选及酶学性质的研究摘要:蛋白酶是一类广泛存在于生物体中的酶类,其具有多种功能。
碱性蛋白酶是一类pH值适宜碱性环境下活性较高的蛋白酶,应用广泛。
本研究旨在筛选出一株高产碱性蛋白酶的菌株,并对其酶学性质进行研究。
引言:蛋白酶在生物体内起着关键的生物调节和代谢调控作用。
碱性蛋白酶是一类活性较高、pH值适宜碱性环境下较为稳定的蛋白酶,被广泛应用于生物工程、制药、食品加工等领域。
因此,筛选高产碱性蛋白酶菌株并对其酶学性质进行研究具有重要意义。
材料与方法:本研究选取了富含烟碱的土壤样品作为实验用菌株的来源。
首先进行了初步筛选,将土壤样品分别接种于含有碱性蛋白酶基质的琼脂平板上,并在适宜的培养条件下进行孵育。
随后,对形成菌落的菌株进行二次筛选,通过培养基的碱性蛋白酶活性测定,筛选出活性较高的菌株,并进行进一步培养。
结果:经过初步筛选和二次筛选,从富含烟碱的土壤样品中分别筛选出了两株高产碱性蛋白酶的菌株。
其中,菌株A的碱性蛋白酶活性达到了每毫升1000 U,菌株B的碱性蛋白酶活性为每毫升800 U。
讨论:这两株高产碱性蛋白酶的菌株在富含烟碱的土壤样品中被筛选出来,表明烟碱可能对菌株具有诱导产碱性蛋白酶的作用。
此外,本研究所筛选出的菌株的蛋白酶活性较高,这对于蛋白质降解和利用具有积极的意义。
酶学性质:对菌株A和菌株B分别进行了酶学性质的研究。
结果表明,这两株菌株的碱性蛋白酶在pH 9.0的条件下具有较高的活性,其酶活性逐渐下降,当pH值低于7.0时基本失活。
在温度方面,菌株A的蛋白酶活性在40°C达到最高值,而菌株B的最适温度为45°C。
进一步的研究发现,菌株A的蛋白酶受到金属离子Cu2+的抑制,而菌株B的蛋白酶对Cu2+较为稳定。
结论:本研究成功筛选出两株高产碱性蛋白酶的菌株,并对其酶学性质进行了研究。
结果显示,这两株菌株的碱性蛋白酶具有较高的活性,适应性较强。
碱性蛋白酶产生菌株的筛选及其酶学性质研究进展

碱性蛋白酶产生菌株的筛选及其酶学性质研究进展
伍先绍;贺稚非;刘琳;龚霄
【期刊名称】《中国食品添加剂》
【年(卷),期】2008(000)003
【摘要】筛选能产生碱性蛋白酶的微生物菌株以及对碱性蛋白酶的酶学性质进行研究,为碱性蛋白酶的广泛应用奠定了基础.本文就近年来国内外对微生物碱性蛋白酶产生菌的筛选和对碱性蛋白酶的酶学性质研究进展进行了综述.
【总页数】4页(P58-61)
【作者】伍先绍;贺稚非;刘琳;龚霄
【作者单位】西南大学食品科学学院,重庆,400715;西南大学食品科学学院,重庆,400715;西南大学食品科学学院,重庆,400715;西南大学食品科学学院,重
庆,400715
【正文语种】中文
【中图分类】TS201.2
【相关文献】
1.产碱性蛋白酶菌株的筛选、分子鉴定及其酶学性质的初步研究 [J], 成堃;路福平;李玉;王盛楠;王建玲
2.产高温碱性蛋白酶菌株筛选及酶学性质研究 [J], 翁海波;敬蔚然;杨丹丽;柳丽平;王志强
3.碱性蛋白酶产生菌株的筛选及鉴定 [J], 张晶;王战勇;韩玉;牛加铸
4.碱性纤维素酶产生菌株的筛选及其酶学性质研究 [J], 陈雅娟;董园;芦志龙;陈东;
黄日波
5.印尼热泉中产嗜热碱性蛋白酶菌株筛选及酶学性质研究 [J], 王帅;林学政;黄晓航;郑立;ZILDA Dewi Seswita
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产碱性蛋白酶菌株的筛选

产碱性蛋白酶菌株的筛选碱性蛋白酶是在碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类,一般最适pH值为9~11,属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类,主要用于加酶洗涤剂中,在制革、纺织、医药、化妆品等的生产中也有广泛的应用。
目前,全世界所生产的酶中碱性蛋白酶占到总产量的30%左右,显示出良好的使用性能和经济价值。
碱性蛋白酶广泛存在于细菌、放线菌和真菌中,其中以芽孢杆菌属的碱性蛋白酶研究的最深入。
微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶,与动植物来源的碱性蛋白酶相比具有产酶量高,适合大规模工业生产的优点。
因此,微生物碱性蛋白酶被认为是最重要的应用型酶类。
本实验从盐碱地采集土样,从中分离出若干株产碱性蛋白酶的菌株。
培养基。
平板培养基( %) : 酵母粉1. 5,蛋白胨0. 5,氯化钠0. 5,琼脂1. 6,pH9。
分离培养基( %) : 酵母膏1. 5,脱脂奶粉0. 5,琼脂1. 6,pH9。
种子培养基%) : 葡萄糖1. 0,蛋白胨0. 5,酵母膏0. 5,KH2PO40. 1,MgSO40. 02,Na2CO31. 0,pH9。
土样采集。
选取采集地点地表植被根系周围的土壤,先除去地表浮土及植被根系,然后挖取深约5cm 的土壤样品。
样品处理。
将土样混合均匀,4℃冰箱保存。
菌株分离( 平板分离法)。
取10g土样装入90ml 无菌生理盐水的三角烧瓶中,100r /min 旋转摇床培养20min,取10 -3,10 -4,10-5稀释液分别涂布于平板培养基上,每个浓度涂布3 个培养皿。
37℃恒温箱倒置培养24h。
观察与保存: 培养24h、48h 后,挑选菌落形态、颜色不一致的菌落保存待用。
筛选采用平板划线法将保存的单菌落划线于分离培养基上。
37℃恒温培养箱中培养24h。
通过观察水解圈的大小初步判断菌株产酶能力的高低,挑选产生透明水解圈大的单菌落接2 环于装有5ml 液体发酵培养基的无菌试管中,30℃条件下旋转摇床培养24h。
5产蛋白酶菌株的筛选2019

三、器材
1.菌株 从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株 2.溶液和试剂 蛋白胨,酵母粉,脱脂奶粉,琼脂,干酪素,三氯醋酸,NaOH,
Na2CO3,Folin试剂,硼砂,酪氨酸,水等 3.仪器和用品 三角烧瓶,培养皿,吸管,试管,涂布棒,玻璃搅拌棒,培养摇
床,高压灭菌锅,直尺,玻璃小漏斗和滤纸
四、操作步骤
1.牛奶平板培养基的配制及灭菌 牛奶平板:在普通肉汤蛋白胨
固体培养基中添加终质量浓度为 1.5%的ห้องสมุดไป่ตู้奶
2.倒平板
四、操作步骤
3.制备土壤悬液 4.涂布 5.培养 6.观察记录
五、注意事项
培养基灭菌条件的控制。
六、实验结果
将菌落计数结果记录于下表中。
七、思考题
1.在选择平板上形成蛋白透明水解圈大小是否能作为 判断菌株产蛋白酶能力的直接证据?为什么? 2.简单设计一方案,从实验中初筛得到的产蛋白酶菌 落里获得某个碱性蛋白酶的高产菌株。
产蛋白酶菌株的筛选
生物制药系 2019年12月
一、实验目的
学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生 菌的方法。
二、实验原理
蛋白酶在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。 微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶,具有产酶量高, 适合大规模工业生产等优点,被认为是最重要的一类营业 性酶类。自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物 学的一项重要工作。 自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后,其 菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。水解圈与菌落直径的 比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选与鉴定

配制 , 15 g・L 琼脂 , pH 7. 5 - 8. 0.
- 1
1. 2. 3 试验试剂 酪蛋白 、 蛋白胨 、 酵母膏 、 琼脂粉等为进口分装产品 ,其他试剂为国产分析纯 .
第 4期
黄志强等 : 产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选与鉴定
落 ,进行划平板分离 . 反复分离至为单一菌落 . [4 - 6] 1. 3. 2 初筛 在酪蛋白培养基上点接纯培养的细菌 . 如果培养的细菌产生蛋白酶 , 则会在菌落周围 产生透明水解圈 ,根据水解圈直径 (D )与菌落直径 ( d ) 的比值 (D / d ) 大小确定产蛋白酶能力较强的菌株 .
碱性蛋白酶是商品蛋白酶中应用最广 、 产量最大的一类蛋白酶 ,主要应用于加酶洗涤剂 、 制革 、 丝绸 、 [1] 食品 、 医药等领域 . Keay将不同芽孢杆菌生产的碱性蛋白酶分成 A 型 ( Carlsberg型 ) 和 B 型 ( Novo 型 ) 枯草杆菌碱性蛋白酶两种类型 ,二者在性能和结构方面很相似 , 最适反应温度都在 50 - 55 ℃, 最适工作
第 35 卷 第 4 期 2006 年 7 月
产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选与鉴定
黄志强 , 林白雪 , 谢联辉 (福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室 ; 福建农林大学植物病毒研究所 , 福建 福州 350002 )
摘要 : 从福建海域的海水 、 海泥及海藻样品中分离到 3 株产碱性蛋白酶的海洋细菌菌株 3B、 6CW 、 15E,采用 16S r DNA 分子 生物学鉴定结合细菌的常规鉴定方法 ,确认分离到的 3 株产蛋白酶的海洋细菌菌株分别是荧光假单胞菌 ( Pseudom onas fluo2
rescens) 、 粘质沙雷菌 ( S erra tia m a rcescens)和氧化短杆菌 (B revibacterium oxydans) ,并对其发酵液中的蛋白酶活力做了初步
耐热碱性蛋白酶产生菌株的分离鉴定及酶学性质研究的开题报告

耐热碱性蛋白酶产生菌株的分离鉴定及酶学性质研究的开题报告一、研究背景及意义耐热碱性蛋白酶是一种有重要应用价值的酶,广泛应用于医药、食品、皮革、环境保护等行业中。
其特点是能在高温高碱环境下稳定地存在和发挥作用,因此受到了广泛关注。
目前,已经有许多研究针对耐热碱性蛋白酶的产生菌株、分离鉴定及酶学特性进行了探究,但在实际应用中,仍存在一些问题需要解决,如酶的稳定性、效率和产量等方面,因此有必要进一步深入研究。
二、研究内容和方法本研究旨在分离鉴定耐热碱性蛋白酶产生菌株,并研究其基本酶学性质,为酶的进一步研发应用提供参考。
具体研究内容如下:1. 采集多种自然环境中的样品,如土壤、水、植物、动物等,通过培养分离的方式筛选产生耐热碱性蛋白酶的菌株;2. 对所得到的菌株进行形态学特征、生理生化特性和16S rRNA序列分析等方法进行鉴定,筛选出优良的菌株;3. 通过固体和液体发酵的方法大量制备菌株产生的耐热碱性蛋白酶;4. 研究酶的基本酶学性质,包括最适温度、最适pH值、热稳定性、抑制剂对酶的影响等;5. 对酶的酶动力学特性进行研究,包括酶的动力学常数、Michaelis-Menten方程、反应速率等。
三、预期结果本研究将分离鉴定出优良的耐热碱性蛋白酶产生菌株,并对酶的基本酶学性质和酶动力学特性进行研究,预计能够得到以下结果:1. 获得产生耐热碱性蛋白酶的优良菌株,为耐热碱性蛋白酶的基础研究和产业应用提供了可靠的物质基础;2. 揭示耐热碱性蛋白酶的基本酶学性质和酶动力学特性,为其进一步应用提供理论支持;3. 为该领域的后续研究提供实验方法和实验结果的参考,推动本领域的发展。
四、研究难点及解决思路本研究面临的主要难点在于如何获得稳定、高效率和高产量的耐热碱性蛋白酶,以及如何解决酶在产业应用中的稳定性问题。
针对这些问题,我们将采取以下解决思路:1. 进行大量的筛选和优化实验,从多个样品中挑选最适合的菌株进行培养和发酵;2. 通过改变培养条件、添加助剂等方法,优化酶的产量和活性,使其符合产业应用的需求;3. 在产业应用中,注意酶的保护和稳定性,避免不必要的失活和损失。
一株高产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选及发酵条件的优化

作者简介: 崔洪霞 ( 】 9 7 7 一 ) ,女,黑龙江 尚志人,博: 士,副教授 ,主要研究方 向为微生物与生化药学,E ma i l :h x c u i @y s u . e d u . C / I 。
一
株 高产碱性蛋 白酶海洋细菌 的筛选及 发酵条件 的优化
崔洪 霞 。 ’ ,李春 林 ,钱 龙 ,孙 滢 ,周艳艳 ,史云柯
( 1 . 燕 山大学 环境 与化 学工程学 院,河北 秦 皇岛 0 6 6 0 0 4 ;2 . 河北省应用化 学重点 实验 室,河北 秦皇 岛 0 6 6 0 0 4 ;3 . 燕山大学 里仁学院 ,河北 秦皇 岛 0 6 6 0 0 4 )
酶 的 强 弱顺 序 为 :p H 值 、培 养 时 间 、接 种 量 、装 液 量 ,菌 株 S DL 9在 较 佳 发 酵 条 件 下 的发 酵 液 的 最 大 酶 活 力 达 1 9 7 . 5 8 U/ mL。本 研 究 表 明 从 秦 皇 岛海 域 可 以获 得碱 性 蛋 白酶 高产 菌株 ,丰 富 了菌 种 资源 。
关键词:碱 性蛋 白酶;筛选 ;海泥 ;菌株 S DL 9 中图分类号:Q9 3 9 文献标识码 :A DOI :1 0 . 3 9 6 9  ̄ . i s s n . 1 0 0 7 — 7 9 1 X . 2 0 1 3 . 0 1 . 0 1 5
0 引言
近 年来 , 碱 性蛋 白酶 由于与传 统 的化 学催化剂 相 比具有 催化 能力强 、底物专 一性 高等优 点,已被 广泛 应用于制 革 、银回收 、医药 、食 品、饲 料 、化 学工业 、废物 处理等生产 及行业 。其最 早发现 于 猪胰 脏 中, 而 1 9 4 5年又 发现于地 衣芽孢 杆菌 中 , 开辟 了微生 物碱性 蛋 白酶 的来源 。 在碱 性蛋 白酶的
印尼热泉中产嗜热碱性蛋白酶菌株筛选及酶学性质研究

基 磺 酰 氟 ( MS ) 亮 抑 酶 肽 (.u et ) 苄 眯 ( ezmi n) 胃蛋 白酶 抑 制 剂 ( e sa 对 该 嗜 热 蛋 白酶 都 有 P F、 I p pi 、 e n Bna d e和 i P pti A) n
一
定 的抑 制 作 用 , 明其 酶 活 性 受到 丝氨 酸 、 胱 氨 酸 残 基 的 影 响 。 结 果表 明 , 菌 株 是 1株 具 有 进 一 步 改造 利 用 说 半 该
王 帅 , 学政 黄 晓航 郑 立 Z L A De ewi 林 , , , I D wi s t S a
(.国 家 海 洋 局 第 一 海 洋 研 究 所 海 洋 生 物 活 性 物 质 重 点 实 验 室 ,山 东 青 岛 2 6 6 ; 1 60 1
2 .印度 尼 西 亚 海 洋 与 渔 业 研 究 局 海 洋 生物 技 术 与水 产 品 加 工 研 究 中 心 , 加 达 9 9 0 ) 雅 9 0 6
有 机溶 剂 、 去污 剂和 变性 剂等 具有 较强 的抗性 , 以 , 所 可有效 地应 用 于需高 温条 件 的工业 生产 中, 取代传 统 的
常温 酶催 化或 化学催 化 方法 , 为在 食 品加工 、 医药 制 品 、 水 处理 、 革 加工 、 纸 等诸 多 方 面 优化 工 艺 流 程 废 皮 造 开辟 出新 的途 径 , 因此 已成为 酶 学领域 研究 的热 点 之一[ ] 5 。这 样 看来 , 于 嗜热 蛋 白酶 的研 究就 显 得 更 为 对
clu e rtemo hl s , i s ta oh r p i ) 短小 芽孢 杆 菌 。 ( a i u u ls , 草 芽 孢杆 菌 . B cl s u t i) 莫 哈 l s u 。 B cl s mi ) 枯 J l p u o( a i u bi s , l s l
碱性蛋白酶产生菌的筛选

文章编号:1001-3717(2006)01-0070-03碱性蛋白酶产生菌的筛选3李树文,陆秀华,尚海利(莱阳农学院生命科学院,山东青岛266109)摘要:本试验从5份土壤中共筛选出产碱性蛋白酶菌株9株,即SHL-4、SHL-6、SHL-7、SHL-10、SHL-8、SHL-11、SHL-12、SHL-18、SHL-20,其中SHL-4、SHL-6、SHL-7、SHL-10产酶效果较好;采用正交试验设计,初步地确定了菌株SHL-4产酶培养基组分,即蛋白胨0.5%、牛肉膏1.5%。
关键词:碱性蛋白酶;筛选;菌株中图分类号:Q939.97文献标识码:AScerrning R ning of Alkaline Protease Producing StrainsL I Shu2wen,L U Xiu2hua,SHAN G Hai2li(Life Science College,L AC,Qingdao266109,China)Abstract:Nine st rains producing alkaline p rotease were screened out f rom five soil samples,namely SHL-4、6、7、10、8、11、12、18、20,SHL-4、6、7、10of which wit h high protease activity.Through an or2 t hogonal test,t he p roducing protease cult ure medium of t he SHL-4st rain was confirmed preliminarily, namely0.5%of pepto ne,1.5%of beef ext ract.K ey w ords:alkaline protease;screening;st rain 碱性蛋白酶是指在碱性的条件下具有活性,能够水解蛋白质肽键的酶类。
产碱性蛋白酶菌株的筛选_分子鉴定及其酶学性质的初步研究

碱性蛋白酶是在碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类,一般最适pH值为9~11,属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类,主要用于加酶洗涤剂中,在制革、纺织、医药、化妆品等的生产中也有广泛的应用[1]。
目前,全世界所生产的酶中碱性蛋白酶占到总产量的30%左右,显示出良好的使用性能和经济价值。
碱性蛋白酶广泛存在于细菌、放线菌和真菌中,其中以芽孢杆菌属的碱性蛋白酶研究的最深入。
本实验从山东东营的盐碱地采集土样,从中分离出若干株产碱性蛋白酶的菌株,并对其进行16S rRNA分子鉴定以及酶学性质的初步研究,以期为工业应用提供基础理论依据。
1材料与方法1.1土样来源山东东营盐碱地中采集土样。
1.2培养基富集培养基:牛肉膏0.5g、蛋白胨1g、NaCl0.5g、水产碱性蛋白酶菌株的筛选、分子鉴定及其酶学性质的初步研究成堃,路福平*,李玉,王盛楠,王建玲(天津市工业微生物重点实验室天津科技大学生物工程学院,天津300457)摘要:从盐碱地土壤中筛选到5株产碱性蛋白酶的细菌,分别命名为TCCC11001、TCCC11004、TCCC11013、TCCC11024、TC-CC11029。
将其革兰氏染色、16S rRNA鉴定为Bacillus subtilis、Bacillus alcalophilus、Bacillus pumilus、Bacillus subtilis、Bacillus licheni-formis。
将菌株接入发酵培养基中,37℃、180r/min摇床培养48h,发酵液进行不同处理后Folin法测定酶活。
结果发现:TCCC11001、TCCC11029的最适作用温度为40℃,TCCC11004、TCCC11013、TCCC11024的最适作用温度为50℃;TCCC11001、TCCC11004、TC-CC11013、TCCC11024、TCCC11029的最适作用pH值分别为10.0、11.0、10.0、9.0、11.0;TCCC11004、TCCC11013于40℃保温2h,残留酶活为最高酶活70%;TCCC11001、TCCC11024、TCCC11029的残留酶活<50%。
碱性产蛋白酶菌株的初筛

2.4恒温培养将涂布好的培养基倒置于37℃温室中培养1~2d。本实验中测定时间40h。
一、实验材料与方法
1、实验材料及仪器
1.1、实验材料
太原市养鸡场土壤、牛肉膏蛋白东培养基、脱脂奶粉
1.2、实验仪器
三角烧瓶、培养皿、吸管、涂布棒、高压灭菌锅、直尺等。
2、试验方法(初筛)
2.1、培养基配制
1)将准备好的牛肉膏蛋白东培养基于高压蒸汽灭菌锅中溶解
2)将溶解的培养基稍冷却,在液体的培养基中加入质量浓度为15%的脱脂奶粉。本实验中,培养基的量为230ml,加入23ml的15%的脱脂灭菌奶粉。摇匀。
二、实验结果及讨论
测定菌落直径、蛋白水解圈直径记录于下:
土壤稀释倍数
菌落直径(mm)
蛋白水解圈直径(mm)
蛋白水解圈/群落直径比值
10-2
1.5
1.7
1.1
0.7
1.0
1.4
10-3
1.0
1.5
பைடு நூலகம்1.5
0.5
0.7
1.4
10-4
1.1
2.1
1.9
0.2
0.3
1.5
10-5
2.0
2.6
1.3
6.0
7.0
参考文献:微生物实验书、青岛大学硕士学位论文《蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及酶学性质研究》、豆丁网论文。
碱性产蛋白酶菌株的初筛
碱性蛋白酶菌株的筛选及产酶条件初探

碱性蛋白酶菌株的筛选及产酶条件初探高玉千,李林柯,刘琦(河南农业大学生命科学学院,郑州,450002)摘要:从四个不同地点采集的土壤样品中,平板分离初筛到9株蛋白酶产生菌,进一步复筛得到一株高产且稳定的碱性蛋白酶菌株B4,初步鉴定为枯草芽孢杆菌。
实验证明其最佳产酶pH8.5,水解温度53℃,发酵时间60h,为下一步进行碱性蛋白酶基因的克隆和诱变奠定基础。
关键词:枯草芽孢杆菌,碱性蛋白酶,筛选Studies on Isolation of Alkaline ProteaseGao Yu-qian, Li Lin-ke, Liu Qi(College of Life Sciences, Henan Agriculture University, Henan, Zhengzhou, 450002) Abstract:9 producing alkaline protease strains were isolated from soil samples, within one strain named B4 was selected and identified as Bacillus subtilis.The optimum conduction for the protease producing consisted of pH8.5, 53℃ and after 60h fermentation. The research could do good preparation for the clone and the mutagenesis of the protease-gene.Keyword:Bacillus subtilis alkaline protease screening蛋白酶是一种重要的酶制剂,在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。
20世纪末国际市场上商品蛋白酶多达80多种,其销售额占酶制剂总销售额的60%以上,而微生物碱性蛋白酶又占了整个蛋白酶40%左右的市场份额,被认为是最重要的应用型酶类[1]。
实验十一 产蛋白酶菌株的筛选

实验十一产蛋白酶菌株的筛选碱性蛋白酶是一类最适宜作用PH为碱性的蛋白酶,在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。
微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶,具有产酶量高,适合大规模工业生产等优点,被认为是最重要的一类营业性酶类。
从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作,也是学习微生物学的学生应该掌握的基本技能。
一基本原理⏹自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后,其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。
⏹水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈,细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大,因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。
⏹碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。
⏹原理:Folin试剂与酚类化合物(Tyr,Trp,Phe)在碱性条件下发生反应形成蓝色化合物,用蛋白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应,通过分光光度计测定可知酶活大小。
二实验目的⏹学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法⏹学习并掌握细菌菌株的药瓶液体发酵技术⏹掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法三实验器材1 菌株从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株2 溶液和试剂蛋白胨,酵母粉,脱脂奶粉,琼脂,干酪素,三氯醋酸,NaOH,Na2CO3,Folin试剂,硼砂,酪氨酸,水等3 仪器和用品三角烧瓶,培养皿,吸管,试管,涂布棒,玻璃搅拌棒,水浴锅,分光光度计,培养摇床,高压灭菌锅,尺,玻璃小漏斗和滤纸四操作步骤1 培养基和试剂的配制(1)牛奶平板:在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶(2)发酵培养基:玉米粉4%,黄豆饼粉3%,Na2HPO4 0.4%,KH2PO4 0.03%,3 mol/l NaOH 调节pH到9.0,0.1MPa 灭菌20min,250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。
产蛋白酶菌株的筛选与酶活力的测定【文献综述】

文献综述生物科学产蛋白酶菌株的筛选与酶活力的测定摘要[摘要]本文主要按照实验设计步骤从海水中筛选出可以产蛋白酶的放线菌,并对获得的放线菌进行初步研究,如形态观察以及酶活力的测定。
从舟山沿海中分离得到几株产蛋白酶的放线菌,并通过酪蛋白平板培养基,水解酪蛋白试验可对菌株的产酶情况进行定性研究,酶活较高的菌株都能产生较大的水解圈。
对其中2株产酶活性较高的菌株进行了以酪蛋白为底物的紫外分光光度法进行酶活性的测定。
[关键词]:蛋白酶;分离纯化;透明圈;酶活力1蛋白酶的简介水解蛋白质肽键的一类酶的总称。
按其水解多肽的方式,可以将其分为内肽酶和外肽酶两类。
内肽酶将蛋白质分子内部切断,形成分子量较小的肽。
外肽酶从蛋白质分子的游离氨基或羧基的末端逐个将肽键水解,而游离出氨基酸,前者为氨基肽酶后者为羧基肽酶[1]。
按其活性中心和最适pH值,又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。
按其反应的最适pH值,分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。
工业生产上应用的蛋白酶,主要是内肽酶。
根据蛋白酶对所作用的反应底物的选择性,一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键。
种类很多,重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。
如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽键。
2蛋白酶的广泛应用蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。
微生物蛋白酶,主要由霉菌、细菌,其次由酵母、放线菌生产。
例如,乳酸菌(lacticacidbacteria,LAB)是一大类能在可利用的碳水化合物发酵过程中产生大量乳酸的细菌,目前已知有200多种LAB[2]。
相当多的LAB是益生菌,其作为益生菌有如下依据:其属于肠道正常菌群,对人和动物的健康是有益的[3]。
在农业、兽医、医学以及食品工业[4、5]中是很重要的。
如果对产蛋白酶的乳酸菌种进行了筛选,并将所产的蛋白酶进行了分离纯化,就可以为酸奶的生产研制和微生态制剂的研发提供更优良的菌种。
碱性蛋白酶高产菌株的筛选

( hmir n ioyE gne o w u n e i ,Y h n3 60 i C e syadBo g n i rfY h nu i rt t l e v sy i u 3 0 0C n c h a)
S H W2 . 0 ;三用电热恒温水箱 ;T L一1 H . 16 0 G 6台式离心 机 ; 7 1型分光光度计 。 2 13 实验方法 .
作 用使蛋 白质水 解为小 肽 和氨基 酸 的生物 酶 J 。它在洗 涤 剂 、制革脱 毛、生丝脱 胶 、有 机合 成 、酒 类 澄 清、明胶 及 蛋 白胨生产 、肉质 嫩化 、医药 等方 面广 为应用 。碱性 蛋 白
酶在 p H为碱性 的范 围内水解 蛋白质肽键的酶 ,最早发现 于 猪胰脏 中。碱性蛋 白酶 广泛 应用 于洗涤 剂 工业 中 ,尤其是 洗衣粉 中 ,目前洗涤剂 中加 入的 碱性蛋 白酶在 5 ℃ 以上 具 O
有 良好 的洗涤 效果 , 要将 水加 热 ,这样 对 于能源 缺乏 的 需 国家和 地区来说是一种 能源 负担 。在 日本 、欧 洲与美 国, j
3 0℃ a d 9.r s e t ey n e p ci l .Th n y ci t h tt e sr n p o u e a p t 4 . U m1 v e e z me a t y ta ta rd c d w su o 2 6 8 / . i v h i
d tr ie o h v h ih  ̄ cii ,rlt ey B ee iigte rlt e e z mea t i ,teo t ltmp rtr n H a ee n d t a etehs ta t t m e v y eai l. y d tr nn h eai ny ci t h pi e eaue a d p w s v m v vy ma
产蛋白酶菌株的筛选

• 每组(产碱性蛋白酶菌分离用) • 1、配置培养基: • 1)牛肉膏蛋白胨培养基: ( 配制200ml放三角 瓶,分装试管5支) • 牛肉膏 3g 蛋白胨 10g • NaCl 5g 琼脂20g • 水 1000ml PH7.0-7.2 • 配置牛奶(分离用)?? • 2)发酵培养基(每组配置350ml 分装6甁): • 玉米粉4 %、 黄豆饼粉3 %、 • Na2HPO4 0.4 %, KH2PO4 0.03 %, • 3mol/L NaOH 调节PH9.0,100ml • 250ml三角瓶的装甁量50ml
• 第四次 • 1、初筛:将斜面培养物接种到发酵培养基; • 每个菌接2个发酵培养基中。 • 培养:37℃、200r/min(每分钟转)摇床培养 48小时 • 第五次 • 酶活力的测定: • 发酵液过滤液1ml+2 %酪蛋白----40 ℃水浴保 温10分钟-----加0.4mol/L三氯醋酸3ml------静置 15分钟-----过滤液1ml-----0.4mol/LNa2CO35ml----Folin试剂1ml----- 40 ℃水浴保温 20分钟--------分光光度计680nm处 测OD值
四、操作步骤
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第一次 实验准备 每组准备: 1、 90ml无菌水一瓶,无菌水10支,各装9ml自来水; 2、移液管9支,用纸包好;(头上塞棉花)、涂布器 3、空白培养皿:6套 4、配制培养基: 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基+牛奶 三角瓶的装甁量 200ml
斜面试管培养基 3支
• 5、发酵培养基:玉米粉4 %、黄豆饼粉3 %、Na2HPO4 0.4 %, KH2PO4 0.03 %, 3mol/L NaOH 调节PH到9.0, 250ml三角瓶的装甁量50ml 6甁 • 5、灭菌: 0.1MPa 20分钟
产碱性蛋白酶菌株的筛选与诱变育种

酶研 究 总体趋 势发 展 较 好 , 主 要集 中在 高 耐 温 碱性 蛋 白酶 和常温 碱性 蛋 白酶 , 但 酶 活力 不 高 仍 是 当前
回收 、 医药 、 食 品加 工 、 饲料、 化学 工业 、 废 物 处 理 等 行 业 。碱 性 蛋 白酶的最 适反 应 p H值 一般 大于 9 . 0 ,
( C o l l e g e o f B i o l o g y , T i a n j i n N o r m a l U n i v e r s i t y , T i a n j i n 3 0 0 3 8 7 , C h i n a )
Ab s t r a c t : I n o r d e r t o o b t a i n s t a b l e hi g h y i e l d o f a l k a l i n e p r o t e a s e s t r a i ns , p r o d u c i n g a l k a l i n e p r o t e a s e s t r a i n wa s
是 目前 市场 上最 为广 泛使用 的蛋 白酶 。微 生物 具有
工 业化 生产 的一 个 最 主要 的 限制 因素 。利 用 物 理 、 化 学 因子 单独 或复 合诱 变选 育高 活力 菌株是 菌种 选
me a s u r i n g e n z y me a c t i v i t i e s , a l ka l i n e p r o t e a s e s t r a i n s we r e p r o d u c e d f r o m c h i c k e n d un g u p o n s a mp l e. Th e s t r a i n b y
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碱性蛋白酶菌株的筛选及产酶条件初探高玉千,李林柯,刘琦(河南农业大学生命科学学院,郑州,450002)摘要:从四个不同地点采集的土壤样品中,平板分离初筛到9株蛋白酶产生菌,进一步复筛得到一株高产且稳定的碱性蛋白酶菌株B4,初步鉴定为枯草芽孢杆菌。
实验证明其最佳产酶pH8.5,水解温度53℃,发酵时间60h,为下一步进行碱性蛋白酶基因的克隆和诱变奠定基础。
关键词:枯草芽孢杆菌,碱性蛋白酶,筛选Studies on Isolation of Alkaline ProteaseGao Yu-qian, Li Lin-ke, Liu Qi(College of Life Sciences, Henan Agriculture University, Henan, Zhengzhou, 450002) Abstract:9 producing alkaline protease strains were isolated from soil samples, within one strain named B4 was selected and identified as Bacillus subtilis.The optimum conduction for the protease producing consisted of pH8.5, 53℃ and after 60h fermentation. The research could do good preparation for the clone and the mutagenesis of the protease-gene.Keyword:Bacillus subtilis alkaline protease screening蛋白酶是一种重要的酶制剂,在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。
20世纪末国际市场上商品蛋白酶多达80多种,其销售额占酶制剂总销售额的60%以上,而微生物碱性蛋白酶又占了整个蛋白酶40%左右的市场份额,被认为是最重要的应用型酶类[1]。
虽然人们对蛋白酶的研究和利用已有多年的历史,但仍存在蛋白酶制剂品种单一、价格昂贵等问题,加上各国都十分注重对已有的重要微生物资源的保护,使得产酶优良菌株的筛选和选育仍是重要的课题,特别是对于发展中国家更是如此[2,3]。
本研究从土壤入手,筛选产碱性蛋白酶的高产菌株,并对其酶学性质进行系统的研究,为下一步获得碱性蛋白酶的基因并得到表达;对蛋白酶基因进行诱变以进一步提高酶活力奠定基础。
l 材料与方法1.1 材料1.1.1样品来源从河南农业大学校园、郑州奶牛场、菜园、杜邦大豆蛋白公司采集土壤样品4个。
1.1.2 培养基牛肉膏蛋白胨培养基用于分离细菌菌落;LB培养基用于菌株的保藏及平板筛选;含1%脱脂奶的L B固体培养基(脱脂奶培养基)用于检查菌株产蛋白酶情况;产酶发酵采用3%豆粕粉的豆粕培养基。
1.2 主要仪器与设备SCS-24型和THZ-82型恒温振荡培养箱、SW-CJ-IC型净化工作台、CS501A型超级恒温器、pHS-3C 型数字型精密pH计、721型分光光度计、Sigma公司产3K30型冷冻超速离心机等。
1.3 方法1.3.1土壤样品的采集选取采集地点地表植被根系周围的土壤,首先去除地表浮土,然后挖取2-5cm深的土壤样品,每个样品约取500g土壤,装入塑料袋内,备用[4]。
1.3.2 菌株的分离取50g土壤样品置于250ml三角瓶中,加入100ml无菌水,用玻璃棒搅拌,静止15min后,涂布于豆粕培养基上,置于37℃培养箱中培养60h。
然后根据菌落大小、形状、表面光泽、隆起程度、透明程度、边缘形状和菌落颜色[5],最终挑选出若干个细菌菌落。
1.3.3 菌株的筛选分离到的菌株采用常规稀释平板法分别接种于脱脂奶培养基,置于37℃培养60h。
室温下观察接种的菌株是否分解培养基中的脱脂牛奶,进而产生肉眼可见的水解透明圈,即可产生分泌胞外蛋白酶。
将可产生透明圈的菌株重新接种脱脂奶培养基,置于37℃培养60h。
根据单菌落透明圈直径与菌落直径比值(H/C)大小进行初筛,从中选取蛋白酶活力相对较高的进行摇瓶复筛。
将初筛得到菌株分别接种于l00ml 豆粕培养基中,37℃摇瓶培养60h。
然后取10ml培养液,再次接种到100ml 豆粕培养基中,37℃摇瓶培养60h后,取10ml培养液,离心收集上清液,用Folin 酚法[6]测定上清液中蛋白酶的活力。
根据OD660吸光数值的大小,初步确定这些菌株产生的蛋白酶的活力。
选取产酶活力最高的菌株作酶学性质分析。
1.3.4 酶学性质分析1.3.4.1 菌株的最佳产酶时间将菌株接种于100ml豆粕培养基中,至于37℃摇床培养,每隔12h取出10ml培养液,测定菌体生长量(OD660),离心收集上清液,然后测定上清液中的pH值和蛋白酶的活力[7]。
1.3.4.2 不同反应pH值对蛋白酶活力的影响将菌株接种在100ml豆粕培养基中,置于37℃摇床培养60h后,离心收集上清液,然后测定蛋白酶的活力。
在测定蛋白酶活力时,分别选择不同的酶反应的pH值,然后测定酶活力。
1.3.4.3 蛋白酶的最适反应温度将菌株接种在100ml豆粕培养基中,置于37℃摇床培养60h后,离心收集上清液。
加入反应物后,在不同温度的水浴中反应10min后,再加入2ml 0.4mol/L三氯乙酸终止反应。
测定酶活。
1.3.5 菌种的纯化配制9ml无菌生理盐水数管,取出一管接复筛菌株一环,混匀后取出1ml加至另外一管中,依次类推进行菌稀释。
用微量移液器分别取各自浓度的菌悬液3μl点到脱脂奶培养基上,60h后观察菌落和水解圈。
1.3.6 菌种的初步鉴定采用细菌形态染色观察及生理生化反应[8]对菌株进行鉴定。
1.3.7 碱性蛋白酶活力测定采用Folin酚法,活力单位(U)以1ml或1g样品在一定条件下,每分钟水解酪蛋白所产生的1μg 酪氨酸数来表示.将测得的OD值代入酶活力计算公式:X=ΔOD*K*n*(4/10)计算酶活(U/mL)。
其中n为稀释倍数,(4/10)为稀释倍数,K为吸光常数100。
2 结果与分析2.1 菌种的分离与筛选通过常规稀释平板分离方法,初筛得到九株蛋白酶活力较高的菌株,分别编号为B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9。
2.2 透明圈试验将九株菌株以无菌牙签点样接种到脱脂奶培养基上,培养18h后观察。
从表1可以看出,B4的比值最大,H/C=7.28,因此用B4作为出发菌株研究酶学性质。
表1 菌落透明圈直径与菌落直径比值表菌株编号B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 H/C 3.7 3.6 2.6 7.2 5.7 3.4 2.3 3.1 4.32.2 初筛菌株蛋白酶活力的OD值660表2 初筛菌株蛋白酶活力的OD660值菌株编号B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9OD6600.164 0.184 0.061 1.365 0.879 0.183 0.040 0.123 0.489 从表2可见4号菌株产酶活力最高。
因此选择该菌株为出发菌株,进一步进行酶学性质研究。
2.3 B4菌株不同培养时间的生长量,酶活力和pH值表3 B4菌株不同培养时间、酶活力和pH值比较培养时间菌体密度OD660酶活OD660酶液pH值12h 重复1 1.012 0.171 6.3 重复2 1.090 0.184 6.5 平均 1.051 0.178 6.424h 重复1 1.860 0.570 7.5 重复2 1.855 0.605 7.5 平均 1.857 0.588 7.536h 重复1 2.403 0.798 8.5 重复2 2.430 0.804 8.3 平均 2.416 0.801 8.448h 重复1 2.498 1.170 8.5 重复2 2.498 1.179 8.5 平均 2.498 1.175 8.560h 重复1 2.500 1.345 8.5 重复2 2.498 1.400 8.5 平均 2.499 1.373 8.572h 重复1 2.501 0.308 9.0 重复2 2.503 0.406 9.0 平均 2.502 0.357 9.0据表3可看出,菌体培养到36h后密度基本稳定,表明此时菌体生长进入稳定期;当培养到60h 时,酶活力达到最高,随后酶活迅速下降。
而pH表现为一直上升最后稳定在8.5-9.0左右。
2.4 不同反应pH值对蛋白酶活力的影响从图1可以看出,pH6.5时酶活力非常低,几乎为零。
随着pH从6.5上升至8.5,酶活力一直2.6菌种的纯化图3是纯化后的平板,上有两个菌落。
2.7菌种的初步鉴定菌落为乳白色,不透明,表面光滑,边缘不整齐;通过显微镜观察,染色后菌株形状为:直杆状,有芽孢和鞭毛,革兰氏阳性。
淀粉水解实验 [8]为阳性,经淀粉酶活力测定具有一定的淀粉酶活性[9],初步鉴定其为枯草芽孢杆菌。
3 结论本研究从土壤中分离到一株产碱性蛋白酶菌株,最佳产酶时间是在菌体生长的稳定期约60h ;pH8.5时酶活力最高;最适水解反应温度为53℃,50℃-60℃酶活较高并相对稳定。
因此可以认为该菌株所产蛋白酶为嗜热的碱性蛋白酶。
参 考 文 献[1] Anwar A ,Saleemuddin M .Alkaline Protease :A Review l-j].Bioresource Tech ,1998,64:175—183.[2] Saeki K ,Hitomi J ,Okuda M ,et a1.A Novel Species of Alkaliphilic Bacillus that Produces an Oxidatively Stable Alkaline Serine Protease[J].Extremophiles ,2002,6(1):65—72.[3] Kumar C G, Takagi H .Microbial Alkaline Protease :from a Bioindustrial Viewpoint[ J].BiotethAdvances ,1999,17:561-594. [4] 刘白玲,何先棋,张义正.B. subtilis 蛋白酶高产菌株的筛选与鉴定[J]。
皮革科学与工程,1996,6 (2):1-8. [5] 王海丰.芽孢杆菌蛋白酶产生条件部分酶学性质及其基因的克隆研究。
四川大学硕士学位论文,2002. [6] 姚占芳,吴云汉主编.微生物学实验技术[M]。
北京:气象出版社,1998. [7] 黄胜.耐高温碱性蛋白酶产生菌GXD9902的筛选及其aprN 基因的克隆。