基因工程制药工艺

具有抗原性，产生热源。
N端增加蛋氨酸容易引起免疫反应。
基因工程制药
工程菌种类
6、大肠杆菌系统生产的药物
❖ 1982年FDA批准重组人胰岛素，18种药物上市。 ❖ 激素：胰岛素及2种突变体（糖尿病）、8种生
长素(1种PEG化)（侏儒症） ❖ 细胞因子类：5种干扰素（1种PEG化）（抗
病毒和肿瘤）、干扰素（多发性硬化）和 2种G-CSF(1种PEG化)（白血病减少症）
Yao Y-F, Wang C-S, Qiao J, Zhao G-R. Metabolic Engineering, 2013, 19: 79–87
基因工程制药
DMS41的生长、耗糖、生物量与原始菌对照相似;缩29.7% 时，严重制约了生长和染色体分离。
缩减基因组，改进代谢效率，减少冗余性，简化调控， 是工程菌改造的重要方向。Science , 2006，312：1044-1046
基因工程制药
工程菌种类
3、大肠杆菌质粒载体
多克隆位点
选择标记
复制子
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白介素-2、白介素-11、白介素-1拮抗剂(风湿 性关节炎)
基因工程制药
工程菌种类
6、大肠杆菌系统生产的蛋白质药物
多肽类2种:甲状旁腺激素(骨质疏松 ) 利尿钠肽(充血性心力衰竭 ）
溶栓酶类：tPA（急性心肌梗塞 ） 白喉毒素-IL 2融合蛋白（T细胞淋巴瘤） OspA脂蛋白（疫苗，预防莱姆病）。 特点：结构相对简单、分子量较小，细胞因子类。 蛋白质类开发空间小，大肠杆菌表达系统应用受限。
MG1655 MDS12 MDS41 MDS43
基因数
4434
4011
3731
3691
基因组/Mb 4.639675 4.263492 3.977067 3.931408
敲除基因数 0
423
703
743
敲除长度 0
376183 662608 708267
占基因组/% 0
8.11
14.28 15.27
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工程菌种类
革兰氏阳性菌（a）与阴性菌(b)细胞壁区别
细胞壁较厚，主 细胞壁较薄，肽聚糖和脂多糖构成。 要由肽聚糖组成。最外层脂多糖，形成内毒素。
细胞壁与外膜双层磷脂之间为周质，
为分泌蛋白质所占据。
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工程菌种类
2、大肠杆菌生化与遗传特性
能在有碳水化合物和氮、磷及微量元素的 无机盐的极限培养基上生长，产气产酸,兼 性厌氧发酵。 基因工程中使用菌株：K－12株的衍生菌株。 基因组：4.6 Mb，编码4000多种蛋白质。 染色体DNA和核外遗传物质质粒为环状双链。
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工程菌种类
5、大肠杆菌系统优点和不足
发展最早、应用最广泛研究/生产的经典的表达系统。
遗传背景清楚、操作技术和方法成熟，目标基因表
达水平高（达70％），培养周期短，抗污染能力强。
不能用于加工修饰化（没有内质网、高尔基体等蛋
白质翻译后的修饰加工的亚细胞器，缺乏糖基化、
酰胺化）蛋白表达。
细胞死亡后，细胞壁脂多糖游离出来，形成内毒素，
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工程菌种类
4、大肠杆菌蛋白质表达形式
不溶性蛋白质：细胞质内形成包涵/含体 可溶性蛋白质：存在于细胞质 周质表达: 外源蛋白被运输分泌到周质，可溶性。 有利于分离纯化和减少降解，避免N端附加蛋氨酸， 需要与信号肽序列基因一起构建表达载体。 胞外表达：可溶性蛋白质分泌到培养液。目标基因 与分泌蛋白融合表达或与膜透性蛋白共表达。
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工程菌种类
缩减基因组的大肠杆菌
匈牙利、美国、德 国科学家，采用合 成生物学策略,通过 计算机模拟预测， 然后实验，连续敲 除冗余基因，获得 了最小基因组的大 肠杆菌。
Posfai G, et al. Science , 2006，312：1044-1046
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工程菌种类
缩减基因组的大肠杆菌
工程菌种类
质粒类型
❖ 严紧型质粒：每个细胞含少数拷贝质粒。 ❖ 松弛型质粒：每细胞含几十至几百拷贝质粒。 ❖ 克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因。 ❖ 测序质粒：用于基因测序。 ❖ 整合质粒：用于外源基因与宿主染色体整合。 ❖ 穿梭质粒：能在两种宿主细胞中分别存在。 ❖ 表达质粒：能表达目标基因产物[蛋白质或代
应用：生产重组蛋白质药物；
生产氨基酸、抗生素、维生素、甾体激素、 药物中间体,紫杉醇、青蒿素…
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工程菌种类
第一节 基因工程制药微生物表达系统
大肠杆菌表达系统 酵母表达系统 其他表达系统
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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工程菌种类
一、大肠杆菌表达系统
1、大肠杆菌（Escherichia coli）形态特征
细胞：G－，单细胞，杆状。鞭毛，无芽孢，裂殖 菌落:白色至黄白色，光滑，直径2－3mm。
谢物]
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工程菌种类
常见质粒及其拷贝数
复制子
质粒
拷贝数 类型
colE1, p15A pBR322 15-25 松弛
pKN402 pMB1改进 pSC101
pMOB45 pUC pSC101
15-118 松弛 500-700 松弛
5
严紧
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工程菌种类
常用抗生素及其筛选机理
抗生素
抗性基因
氨苄青霉素ampicillin Amp/AP/bla
氯霉素chloramphenicol Chl/CM/cat
卡那霉素kanamycin Kan
链霉素streptomycin Str
四环素tetracycline
Tet
新霉素Neomycin
Neo
筛选机理 水解内酰胺环 酰基转移修饰 磷酸转移修饰 水解 外排 磷酸转移修饰
制药工艺学
Pharmaceutical Technology
基因工程制药工艺
第一节 基因工程制药微生物表达系统 第二节 基因工程大肠杆菌的构建技术 第三节 基因工程菌的发酵培养与控制
基因工程制药
工程菌种类
基因工程菌：以微生物为操作对象，通过 基因工程技术获得的表达外源基因，或过 量表达或抑制自身基因的工程生物体。
基因工程制药
工程菌种类
大肠杆菌生产天然药物：紫杉醇前体紫杉二烯
通过代谢设计，上下游模块适配，构建工程菌； 优化发酵工艺，紫杉二烯产量达1g/L
Pajikumar PK, et al. Science, 2010, 330: 70-74
基因工程制药
工程菌种类
大肠杆菌生产丹参素
构建丹参素人工 合成途径，以葡萄糖为碳源，进行发 酵，丹参素产量：7g/L