一株反硝化菌的分离与鉴定

一株高效好氧反硝化菌的分离及特性研究
杨俊忠，倪砚，许尚营，徐可瀚，刘义，曾丽霞，刘德立∗
华中师范大学生命科学学院，湖北省遗传调控与整合生物学重点实验室，武汉 （430079）
E-mail: deliliu2002@
摘要：利用富集培养的方法从南昌市郊某养鱼塘采样分离出22株反硝化细菌，其中8株反硝化率较高，从中选择一株效果最好的作为研究对象，命名为HS-N62。

该菌在12h将培养基SC 中起始浓度为140mg/L的硝酸盐氮（NO3-N，10mmol/L）完全降解，并且没有NO2-的积累。

对其生长特性进行了研究，最适生长温度的范围是30℃-37℃，最适生长的pH 值范围是6. 0～8. 0，最适C/N比为10：1，并能利用多种碳源生长。

运用正交试验探讨了该菌株最适的反硝化条件。

通过菌株形态观察、生理生化及16S rDNA 分子鉴定，菌株HS-N62与Pseudomonas sp.亲缘关系最为接近，同源性达99 %，初步鉴定该菌为Pseudomonas sp.。

关键词：好氧反硝化；分离鉴定；特性研究
1. 引言
近几十年来，我国水产养殖业迅猛发展，但在水产养殖过程中的氨、硝酸盐、亚硝酸盐、磷酸盐等营养元素含量过高所造成的富营养化现象日益严重，结果造成大量鱼虾死亡，最终导致重大经济损失，因此，控制水体中的硝态氮和亚硝态氮成为规模化养殖成功的关键之一[1]。

反硝化是将硝酸盐或亚硝酸盐还原成N
O或N2的过程。

传统观点认为：反硝化细菌大
2
都是兼性厌氧，细菌的反硝化作用是在无氧条件下发生。

但近几年国内外的不少研究报道证明好氧反硝化菌的存在。

细菌好氧反硝化的发现,突破了传统理论的认识，为生物脱氮技术提供了一种崭新的思路[2]。

具有反硝化能力的细菌就目前所知分布于50 多个属，许多菌属如假单胞菌属( Pseudomonas )、产碱菌属( Alcaligenes)和副球菌属( Paracoccus ) 都存在好氧反硝化现象[3]。

本文从常年养鱼的池塘中采样筛选出多株好氧反硝化细菌，并研究了其生长条件及其反硝化效率，可为好氧反硝化脱氮的实际应用提供依据。

2. 材料与方法
2.1 培养基
富集培养基（SM，g/L）：NaNO3 0.85，丁二酸钠2.84，KH2PO4 1.36，MgSO4·7H2O 0.19，2 ml 微量元素溶液，pH 7.0～7.4。

反硝化培养基(SC，g/L)：NaNO3 0.85，丁二酸钠 4.72，酸水解酪素5.0，Na2HPO4 7.9，KH2PO4 1.5，MgSO4·7H2O 0.10，2 ml 微量元素溶液，pH 7.0～7.4。

微量元素(g/L)：CuSO4·5H2O 4.0，FeSO4·7H2O 0.70，FeCl3·6H2O 7.0，CoCl3·6H2O 0.20，NaMO4·2H2O 3.4 0，CaCl2·2H2O 2.0，pH 7.0 [3-4]。

BTB培养基(g/L)：丁二酸钠4.72，NaNO3 0.85，KH2PO4 1.0，FeSO4·7H2O 0.2，MgSO4·7H2O 0.1，琼脂15，pH 7.0。

基金项目：教育部博士点基金项目(20060511002)和“211”重点学科建设项目；湖北省科技攻关计划项目(2007AA201C50，2007AA301C26)。

2.2 富集培养和菌种分离
从常年养鱼的池塘采样，将1g样品加入装有100mL SM培养基的500mL锥形瓶中，30℃静置培养3-4d，待培养基浑浊。

取10mL菌悬液于100 mL新鲜SM的锥形瓶中培养，重复操作5-6次。

将最后得到的菌悬液稀释涂布于BTB培养基。

置30℃下培养到长出明显菌落，用接种环挑取不同形态单菌落于新鲜的SM中振摇过夜(30℃)。

重复操作2-3次，直至平板菌落形态单一，无其它形态的菌落为止[3]。

2.3 菌体形态观察和生理生化鉴定
取适当稀释的反硝化细菌纯培养液涂平板，置30℃培养。

待长出菌落后，观察菌落的大小、颜色等特征。

采用革兰氏染色，观察其个体形态。

细菌生理生化鉴定根据《常见细菌系统鉴定手册》进行鉴定[5-6]。

2.4 16S rDNA 序列分析
细菌基因组DNA 的提取方法见文献[7]。

16S rDNA PCR 反应引物为通用引物，即正向引物为BSF8 (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，引物为BSR1492 (5’-GGTTA CCTTGTTACGACTT-3’) (上海基康公司合成)。

PCR 反应体系(25µL)：2.5µL 10×PCR缓冲液，3.5 µL MgCl2（3 mmol/L），0.5 µL 模板DNA ，0.5 µL Pf和Pr，1µL dNTP，0.5µL Taq Polymerase，16µL 超纯水。

PCR 扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环30 次；72℃终延伸10 min[3,8]。

PCR产物采用纯化试剂盒纯化，测序由北京三博远志公司完成。

测序结果提交GenBank进行blast比对。

2.5 反硝化能力的测定
挑取单菌落于SC 培养基中过夜培养，按1%的接种量（前培养物OD600为1）接种到装有100mL SC培养基的500mL锥形瓶中，30 ℃，120 r/min培养12h，每隔一定时间取样，测定培养基中剩余的c (NO3- ) 、c (NO2-)和c（NH4+），计算其去除率。

硝酸盐氮测定采用磺酸Brucine 法；亚硝酸盐氮测定采用N - (1-萘基) -乙二胺光度法；氨氮的测定采用纳氏试剂分光光度法。

2.6 正交法测定不同条件下的硝酸盐去除能力
采用L9 (34 )正交表，按4因素3水平进行正交试验设计，考虑温度、pH、C/N和不同碳源，分别测定12 h和24 h时SC培养基中剩余的c (NO3- )，计算其去除率[9-12]。

2.7 菌株NO3-和NO2-耐受度检测
配制不同浓度的以NaNO3为唯一氮源的培养基，使NO3-的最终浓度为20、50、100、150和200 mmol/L。

再以NaNO2代替NaNO3为唯一氮源，使NO2-的最终浓度为5、10、20、50和100 mmol/L。

在最优的条件和下培养，分别测定24 h和48 h时SC培养基中剩余的c (NO3- )，计算其去除率[9]。

3. 结果与分析
3.1 菌株形态观察和生理生化鉴定
从常年养鱼的池塘采样分离筛选出22株反硝化细菌，其中8株反硝化率较高，从中选
择效果最好的一株作为研究对象，命名为HS-N62。

该菌菌落较小，圆形、整齐、隆起，乳白色，色泽一致，且质地均匀。

革兰氏染色呈阳性（G +）。

观察该菌呈杆状或棍棒状，1～2 µm 。

生理生化鉴定见表1。

表1 菌株HS-N62主要的生理生化特征
Table 1 Main physiological characteristics of strain HS-N62
鉴定指标 鉴定结果 鉴定指标 鉴定结果
葡萄糖 +
木糖 -
麦芽糖 -
甘露醇 -
精氨酸双水解酶 +
明胶液化 + DNA 酶 - 反硝化 + 七叶灵 - 氧化酶 + 硫化氢 - 接触酶 +
(“+”为阳性，“-”为阴性)
3.2 16S rDNA 序列测定
HS-N62的16S rDNA 全序列长1492 bp ，将测得的16S rDNA 基因序列在GenBank 数据库中通过Blast 方法比对，用NJ 法构建进化树（图1）。

结果表明该菌株与Pseudomonas sp.同源性达99%。

结合菌株的形态学和生理生化鉴定可初步确定HS-N62菌株为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。

图1 菌株HS-N62同相近序列采用NJ 法构建的系统进化树
Fig.1: Phylogenic tree of strain HS-N62 and similar sequences in Gene Bank, constructed by Neighbor Joining
Method
3.3 菌株反硝化能力的测定
菌株HS-N62在12 h 硝酸盐氮由140 mg/L 降至5.46 mg/L ，降解率达96%。

该菌在反硝化过程中有亚硝酸盐的产生，亚硝酸盐氮的产生量在9h 达到最高，为89.4 mg/L ，但随着菌量的增长，亚硝酸盐氮的积累量减少，12h 减少为5.4 mg/L ，24h 时减少至0，这是由于硝酸盐氮可先被还原为亚硝酸盐氮，亚硝酸盐氮再逐步被还原为氮气。

SC 培养基中氨态氮的初始浓度为20 mg/L ，在培养过程中也有少量的氨态氮产生，在9h 达到最高，为57.13 mg/L
，
之后就呈下降的趋势。

SC培养基的初始pH为7.4，培养12h后上升到8.2，原因可能是碳源丁二酸钠的代谢产物呈碱性（图2）。

图2 菌株HS-N62的反硝化能力测定
Fig.2：Denitrifying capability of strain HS-N62
3.4 HS-N62反硝化最适条件的确定
运用正交试验法，设计不同组合（表2），对菌株HS-N62在不同条件下反硝化能力进行了测定并作方差分析。

由表2按照极差决定因素影响菌株HS-N62反硝化能力的主次顺序为：A（温度）﹥B（pH）﹥D（C源）﹥C（C/N）。

菌株HS-N62的最佳组合为A3B2C2D2，即利用丁二酸钠为碳源，C/N为10：1，pH 7，35℃。

多因素试验与各单因素试验结果基本一致。

表2 菌株HS-N62的正交试验结果
The results of orthogonal experiment of strain HS-N62
菌株HS-N62在20 ℃～37 ℃均能生长，在30 ℃～37 ℃时生长状态和硝态氮去除率较好，并且没有亚硝酸氮的积累。

HS-N62 生长pH 范围较宽，在pH 5～pH 10时都能生长，在pH 6～pH 9生长状态和反硝化率较好。

菌株HS-N62在不同的碳氮比的情况下都有较高的反硝化率，碳氮比为5～15时，硝态氮的去除率在24h 都能完全降解。

甚至在碳氮比为30：1的情况下也有较高的反硝化率，说明该菌在高的碳氮比废水的处理中有较好的应用前景。

碳源对菌株HS-N62反硝化能力的影响如图3。

不同碳源利用实验表明：HS-N62能利用不同的碳氮源，但不同碳源种类对菌株反硝化能力有明显影响，在葡萄糖、乳糖、蔗糖、甲醇和甘油为碳源的培养基中生长良好，有较高的反硝化率。

图3 不同碳源对菌株HS-N62反硝化作用的影响
Fig.3: Denitrification activity of stain HS-N62 under different carbon source
3.5 菌株HS-N62的NO 3-和NO 2-耐受度检测
菌株HS-N62在NO 3- 浓度为20 mmol/L 时硝态氮去除率仍然能达到100%，在100 mmol/L （1400 mg/L ）时去除率大于60%。

HS-N62菌株对亚硝酸盐的利用情况如图4（b ）
所示，菌株HS-N62能以亚硝酸钠为唯一氮源生长并能降解NO 2-，
在5 mmol/L 和10 mmol/L 时都能完全降解。

对NO 3-和NO 2-耐受度测定表明HS-N62能利用高浓度的硝酸根和亚硝酸根生长并降解，具有较好的应用价值。

（a ） （b ）
图4 NO 3-和NO 2-的浓度对菌株HS-N62反硝化作用的影响
Fig.4: Effect of NO 3- and NO 2- on denitrification of strain HS-N62
4. 讨论
本研究从常年养鱼的池塘中以丁二酸钠为碳源的反硝化培养基在好氧条件下进行富集分离，得到一株反硝化能力较高的菌株，命名为HS-N62。

实验证实菌株HS-N62在好氧条件下有较高的反硝化率，硝酸盐氮在12 h由140 mg/L降至5.46 mg/L，降解率达96%。

在硝酸盐氮去除过程中没有亚硝酸盐和氨态氮的积累。

菌株HS-N62能耐受较高浓度的硝酸盐，在硝酸盐氮100 mmol/L（1400 mg/L）时24h的硝态氮去除率仍能达到60%。

该菌能以亚硝酸盐氮为唯一氮源进行生长且有较好的去除亚硝酸盐氮能力，耐受浓度达10 mmol/L。

通过菌株形态观察、生理生化及16S rDNA 分子鉴定，初步鉴定HS-N62为假单胞菌属。

但革兰氏染色该菌呈阳性，这与假单胞菌为革兰氏阴性菌不符，该菌是否为假单胞菌属的新种，还有待于进一步鉴定。

HS-N62能在富磷培养基中也能够良好生长，其是否有具较强的除磷能力还有待于进一步检测。

反硝化菌的硝酸还原酶（NaR）有两种形式，分别为膜结合硝酸盐还原酶和周质硝酸盐还原酶[13-14]。

亚硝酸还原酶（NiR）也有两种形式，分别为测定cd1细胞色素型(cdl-NiR)，一种是铜结合型(Cu-NiR )[9,15]。

HS-N62的硝酸还原酶和亚硝酸还原酶为何种形式还有待于进一步研究确定。

参考文献
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Isolation and Characterization of a High Efficiency Aerobic
Denitrifier
YANG Junzhong, NI Yan, XU Shangying, XU Kehan, LIU Yi,
ZENG Lixia, LIU Deli
Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology, College of Life Science,
Central China Normal University, Wuhan (430079)
Abstract
Twenty two bacteria strains with a capacity of denitrification were isolated from perennial fish pond，of which eight strains have the high rate of denitrification while one strain named HS-N62 has the strongest effect of denitrification. 10 mM nitrate was removed by HS-N62 in 12 hours and no NO2-accumulation. After study of the bacterium's growth, our results showed that the optimum growth temperature ranged from 30℃ to 37℃, pH value from 6.0 to 8.0 and the optimal C/N ratio 10:1. Meanwhile the bacteria could take advantage of a variety of carbon sources during the growing process. The most suitable denitrification condition about HS-N62 was confirmed by using a series of the orthogonal test. The homology of 16S rDNA sequences between the strain HS-N62 and Pseudomonas cf. is 98% by comparing their 16S rDNA. Based on the morphological characteristics, physiological and biochemical characteristics, the strain HS-N62 was identified as Pseudomonas sp.
Keywords: aerobic denitrification; isolation and identification; characteristic research
作者简介：杨俊忠(1984- )，男，硕士研究生，研究方向为环境微生物学与分子生物学，E-mail：junzhong55@；通讯作者，刘德立，男，教授，博士生导师，研究方向为环境微生物学与分子生物学。

E-mail：deliliu2002@。