无菌检查方法培训

阴性对照
应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性
对照，阴性对照管不得有菌生长。
供试品溶液配制
确定供试品溶液配制方法
取规定量，混合至适量的无菌十四烷酸异丙酯中，剧
烈振摇，使供试品充分溶解。加入100ml PH7.0蛋白质 缓冲液稀释液，充分萃取，静置，取下层水相作为供 试液过滤。 冲洗液：1%聚山梨酯80 稀释液：ph7.0蛋白胨缓冲液
数量，成品每亚批均应进行无菌检查。除另有规定外， 出厂产品按表1规定；上市产品监督检验按表2规定。 表1、表2中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试 品用量。
检验量：是指供试品每个最小包装接种至每份培养基
的最小量（g或ml）。除另有规定外，供试品检验量 按表3规定。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接 种两种培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基 和胰酪大豆胨液体培养基。采用薄膜过滤法时，只要 供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。
无菌检查法的有关概念
4、无菌技术 是指能在微生物试验工作中，控制或防
止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有 关措施，其中包括无菌环境设施、无菌试验器材及无 菌操作。 5、无菌检查法的局限性 若供试品符合无菌检查法的 规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物 污染。也就是无菌试验并不能用于保证整批产品的无 菌性，但是它可用于确定批产品不符合无菌要求
生孢梭菌斜面三代 白色念珠菌斜面三代 黑曲霉斜面三代
（2）菌液制备
金葡
铜绿 枯草
至TSB或TSA上
生孢
硫乙醇酸盐 液体培养基
SDA或SDB
30-35℃培养 18-24小时
白念
20-25℃培养24-48小时
菌液制备
黑曲霉 加入3-5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
无菌检查法的有关概念
6、无菌产品 生产工艺分为两类最终灭菌产品和部分
或全部在无菌工艺下生产的产品 7、无菌工艺 在一个受控环境下对无菌产品，包装容 器和或器械进行处理，该受控环境的送风，物料，设 备和人员按照法规要求保持无菌状态。 8、最终灭菌：针对密封的最终产品采用一种杀灭方 式，期望达到预定的无菌保障水平（SAL），通常不 小于10-6 比如一百万单位产品种污染概率小于一个单 位。是一个产品在最终确定包装中的灭菌过程
一支
各两支
（共7支）培养3天，逐日观察结果
枯草（小于100cfu） 白念（小于100cfu） 黑曲（小于100cfu） 空白
各两支
（共7支）培养5天 ，逐日观察结果
一支
⑸结果判定
空白对照管应无菌生长
加菌的培养基管均应生长良好
五、方法验证（薄膜过滤法）
检验数量：是指一次试验所用供试品最小包装容器的
F0值
F0 ＞12 过度杀灭法 8≤F0 ＜12 过度杀灭法 F0 ＜8 热稳定性很差的产品
无菌检查的特点和意义
抽样检查是无菌检查的特点 当污染率为0.1%时，抽样20支进行无菌检查，通过无
菌检查的可能性为98%。即当污染率为0.1%时，要有 95%以上的可信度检出其无菌不合格，需至少检验 3000支。
无菌检查法的有关概念
9 生物负载：灭菌前单位物质所含有的所有微生物的
水平 10 清洁：采用化学和或物理方式去除表面灰尘和或微 生物 11消毒：从无生命物体的表面清除包括潜在病原微生 物的过程。不必杀死所有微生物，但将其降低到符合 规定用途的水平。 12 杀菌：破坏或抑制微生物，起到限制或防止有害感 染或危害发生的作用。
胰酪大豆胨液体培养基
用于真菌和需氧菌的培 养 枯草、白念、黑曲
培养基接种
培养条件
30-35℃
20-25℃
2、无菌性检查
每批培养基随机取不少于5支（瓶），置各培养基规定
的温度培养14天 结果：应无菌生长
3、灵敏度检查
（1）菌种
金黄色葡萄球菌斜面三代 铜绿假单胞菌斜面三代
枯草芽孢杆菌斜面三代
然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至10ml无菌试管 内。
适宜的方法：用无菌玻棒或接种环将孢子洗脱，然后
用一支10ml移液管，其管口用无菌棉花或纱布包扎且 能过滤菌丝的装置，吸出孢子悬液至无菌试管内。
菌液制备
⑷培养基接种

金葡（小于100cfu） 铜绿（小于100cfu） 生孢（小于100cfu） 空白
阳性对照
应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗
革兰阳性菌为主的供试品，以金葡为对照菌；抗革兰 阴性菌以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品， 以生孢为对照菌；抗真菌的供试品，以白念为对照菌。
供试品的用量同是视频无菌检查时每份培养基接种的
样品量。 阳性对照管培养72小时内应生长良好。
无菌检查

一、无菌检查法的有关概念和新理念
1、无菌 是指某一物体或某一环境中不含有活的微生
物 2、无菌检查法 用于检查药典要求无菌的药品、生物 、 医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方 法。 3、无菌操作 是指在无菌环境条件下，在对无菌制品 或无菌器械等进行检验的过程中，能防止微生物污染 与干扰的一种常规操作方法。
无菌检查法的有关概念
Z值
F 0值
F0值：一定灭菌温度(T)下，Z为10℃时所产生的灭菌
效果与121℃，Z值为10℃所产生的灭菌效果相同时所 相当的时间(min)。也就是说，不管温度如何变化，t 分钟内的灭菌效果相当于在121℃下灭菌F0 分钟的效果 在湿热灭菌时，参比温度定为121℃，以嗜热脂肪芽孢 杆菌作为微生物指示菌，该菌在121℃时，Z值为10℃。 则显然，即把各温度下灭菌效果都转化成121℃下灭菌 的等效值。因此称F0为标准灭菌时间（min）。F0目 前仅应用于热压灭菌。
筛选阳性菌及冲洗量选择试验
筛选阳性菌及冲洗量选择试验
发现抑菌作用处理方法
前处理增加溶解度(对于薄膜过滤法) 增大冲洗量 增大稀释度
采用中和剂
通过试验确定无菌检查方法。
问题。
三、无菌检查法的新理念
Fra Baidu bibliotek 无菌检查法的新理念
2、实验者由严格按照标准检验，向依据统一的原则，
选择适宜的方法检验转变
3、新方法与新技术掌握和应用
4、偏差调查与趋势分析
四、培养基保证
培养基无菌性检查 培养基灵敏度检查
1、培养基
硫乙醇酸盐流体培养基
培养对象 主要用于厌氧菌的培养， 也可用于需氧菌的培养 金葡、铜绿、生孢
表1
表2
表3
计算
我公司产品愈创蓝油烃软膏（批量
1吨，20g/支）的检验数量、检验量？
答案：检验数量：10支；检验量：0.5g*10 阳性对照用量
菌种及菌液
除大肠埃希菌外，金葡、枯草、生孢、
白念、黑曲的菌株及菌液制备同培养 基灵敏度检查。 大肠埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄 球菌
F值
F值为在一定温度（T）下，给定Z值所产生的灭菌效
果与在参比温度（T0）下给定Z值所产生的灭菌效果 相同时，所相当的灭菌时间，以min为单位。F值常用 于干热灭菌。 F值的数学表达式如下：F = △t ∑10 式中，Δt为测量被灭菌物温度的时间间隔，一般为 0.5～1min，T为每个时间间隔Δt所测得被灭菌物温度， T0为参比温度。
抽样、破坏性检查的特点决定无菌检查只能采取一次
性检查结论，这让无菌检查非常困难。
二、无菌检查的特点和意义
由于抽样概率的限制，通过无菌检查发现产品微生物
污染的可能性极低，而当前坚持无菌检查的意义在于：
产品上市前发现重大污染事件的最后一道关口；
通过无菌检查的执行情况可以窥视其无菌控制存在的