EMSA化学发光法EMSA试剂盒
EMSA、CHIP.亚细胞定位
EMSA实验材料：EMSA探针生物素标记试剂盒（20；1358）；化学发光EMSA检测试剂盒（100；1399）；正电尼龙膜（20；458）；细胞核蛋白提取试剂盒（50；462）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（200；170）；压片暗盒（1个；138）；PMSF试剂（1g;118）实验方法：一、探针制备：1.准备工作：A.取出TdT Buffer (5X)、Biotin-11-dUTP和Ultrapure water溶解，并置于冰浴上备用。
B.取出待标记的单链EMSA探针，用水稀释至1μM，并置于冰浴上备用。
如果待标记的EMSA探针为双链，95℃加热2分钟，然后立即放置到冰水浴中，使双链的EMSA 探针转变为单链的探针，然后同样用水稀释至总的单链DNA浓度为1μM，即每条单链的浓度为0.5μM，相当于最初双链的EMSA探针浓度为0.5μM。
2.DNA 探针的标记:Ultrapure water 29ulTdT Buffer (5X) 10ul待标记探针(1μM) 5ulBiotin-11-dUTP (5μM)5ulTdT (10U/μl)1ul总体积50ulA.参考上表设置反应体系。
注：对于双链的EMSA探针的标记反应，建议一次做两管，即总体积共100μl，以最终获得足够的生物素标记EMSA探针用于后续EMSA检测。
B.用枪轻轻吹打混匀，切勿vortex。
37℃孵育30分钟。
C.加入2.5μl 探针标记终止液，轻轻混匀终止反应。
3.TdT 的去除:A.探针标记反应终止后，加入52.5μl氯仿-异戊醇(24:1)，vortex使有机相和水相充分混合以抽提TdT(说明：静止后有机相和水相会很快分层)。
B.12000-14000g离心1-2分钟。
吸取上清备用。
上清即为被生物素标记的单链DNA探针。
4.探针的纯化( 选做) ：通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。
有些时候，纯化后的探针会改善后续实验的结果。
凝胶迁移(EMSA)实验总结
EMSA实验总结实验原理：凝胶迁移实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究蛋白与核酸（DNA/RNA）相互作用的技术。
实验步骤：（参考碧云天化学发光法EMSA 试剂盒）1.蛋白：利用原核表达蛋白，进行纯化后测定蛋白的浓度（BSA法测定）。
4 ℃保存。
注：提取的植物总蛋白（贝博试剂盒）进行EMSA实验，蛋白易滞留在点样孔，具体原因尚不明确。
2.探针：合成biotin标记的探针、未标记的探针、突变探针（需要HPLC纯化）。
注：合成单链探针，使用时1:1混合，利用PCR仪合成双链探针。
具体步骤：探针根据使用浓度用DEPC水稀释，正链：反链 = 1:1 ,PCR程序：75 ℃30 min，以后每个循环降低0.1 ℃，直到0 ℃。
3.6 % EMSA非变性胶：制胶前需要把制胶模具清洗干净，不能有SDS残留。
一块胶的用量（6 mL），不用制浓缩胶。
5 × TBE 1 mL30 % acrylamide/bisacrylamide 2 mL40 % 甘油 625 μLO 3.125 mLdd H210 % 过硫酸铵 150μLTEMED 5 Μl4.EMSA结合反应：（20 µl反应体系，蛋白和探针根据实验需求和预实验进行调整）阴性对照反应：Nuclease-Free Water add to 20 µlEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 4µl标记好的探针样品反应：Nuclease-Free Water add to 20 µlEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 4µl细胞核蛋白或纯化的转录因子标记好的探针探针冷竞争反应：Nuclease-Free Water add to 20 µlEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 4µl细胞核蛋白或纯化的转录因子未标记的探针标记好的探针突变探针的冷竞争反应：Nuclease-Free Water add to 20 µlEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 4µl细胞核蛋白或纯化的转录因子未标记的突变探针标记好的探针Super-shift反应：Nuclease-Free Water add to 20 µlEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 4µl细胞核蛋白或纯化的转录因子目的蛋白特异抗体标记好的探针在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25ºC)放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。
emsa方法
emsa方法
哎呀，咱今儿个就来唠唠 emsa 方法。
这 emsa 方法啊，就像是一个神奇的魔法棒，能在生物学的世界里变出好多奇妙的东西呢！
你想想看，它就像一个超级侦探，能帮我们找到那些隐藏在细胞里的秘密。
它能让我们看到蛋白质和核酸之间的互动，就好像在看一场精彩的舞台剧，蛋白质和核酸就是舞台上的主角，它们在那里演绎着各种故事。
咱就说，要是没有 emsa 方法，我们怎么能知道这些分子之间有着这么多有趣的关系呢？这就好比你不知道你的好朋友心里在想啥，那多无趣呀！emsa 方法就帮我们打开了这扇了解分子世界的大门。
它操作起来也挺有意思的。
要准备各种试剂啦，要设置合适的条件啦，就跟做饭似的，得把握好各种调料的比例，火候也得恰到好处，不然可就做不出美味的菜肴啦。
做 emsa 实验也是一样，每个步骤都得精心对待，稍有疏忽可能就看不到想要的结果咯。
而且啊，这 emsa 方法还特别灵敏呢！一点点小小的变化都能被它察觉到。
就像一个超级敏锐的小雷达，任何风吹草动都逃不过它的法眼。
你说它是不是很厉害？它能让我们更深入地了解生命的奥秘，为生物学的研究提供重要的支持。
有了它，我们对疾病的发生机制、药物的作用原理等等都能有更清楚的认识。
咱再想想，如果没有 emsa 方法，那些科学家们得走多少弯路呀！它就像一盏明灯，照亮了我们在生物学道路上前行的方向。
所以啊，可别小瞧了这 emsa 方法。
它虽然看起来不起眼，但在生物学的领域里可是有着举足轻重的地位呢！它就像一个默默奉献的幕后英雄，为我们解开一个又一个的谜题。
你说，它是不是值得我们好好去研究和利用呢？我觉得那是必须的呀！。
EMSA操作方法(原核表达纯化蛋白)
三、凝胶滞留试验(EMSA)凝胶迁移滞留试验(electrophoretic mobility shift assays,EMSA)是研究核酸与蛋白质相互作用简单、快速、敏感的方法,目前已经成为转录因子研究的经典方法,并且用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合,电泳时这种复合物比无蛋白结合的自由探针在凝胶中泳动的速度慢,即表现为相对滞后。
(一)转录因子-标签融合蛋白和标签蛋白的原核表达纯化以GST标签为例。
裂解液:25mM pH7.8Tris-HCl、100mM NaCl、2 mM NaEDTA、1mM DTT和21×Complete Protease InhibitorCocktail。
洗脱液:50 mMpH7.8Tris-HCl、200mM NaCl、1mM DTT、0.02%(v/v)Triton X-100和10 mM还原性谷胱甘肽。
EDTA、1mM DTT和1×Complete 透析液:25mM pH8.0 Tris-HCl、1mM Na2Protease InhibitorCocktail。
1将转化了pGEX-4T-2载体或者pGEX-4T-2-目的基因重组载体的BL21大肠杆菌在5 mL含100 μg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中37℃、200 rpm震荡培养12 h。
2 取1 mL菌液加入100 mL 含100 μg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中,37℃、200 rpm震荡培养至OD600为0.5左右。
3 加入IPTG至终浓度为0.5 mM,28℃、200 rpm培养6 h。
4 冰上放置10 min,4℃、3000×g离心15 min,收集菌体并称重。
5 每克菌体加入3 mL裂解液,重悬菌体,加入溶菌酶至终浓度为0.5 mgmL-1,在冰上温和地搅动菌液30 min。
6 超声波破碎30 s(破碎10 s停10 s)。
EMSA实验技术探讨
EMSA实验技术探讨EMSA是一个比较复杂的试验技术,由于工作原因接触这个试验技术到现在也有三年多的时间了,做了大概也有几百次吧, 那倒理想的试验结果的同时也碰到了很多莫名的问题和结果,到现在为止还有没有解决的,找不到原因的一个问题,呵呵! 现和smalldonkey商量一下将我对这个实验技术的总结和一个心得写出来给大家分享,批评指正.EMSA实验技术作为一个经典的DNA/protein,RNA/protein的检测技术,不是很多简单的实验技术可以替代的!比如曾经在我们这个论坛中有站友提到这样一个问题:某公司的激活-和转运检测试剂盒，监测是否激活NF-KB测试剂盒原理：NF-κB未被激活时和IκB-α形成一个复合物，分布在细胞浆中。
在炎症因子、生长因子或趋化因子等可以激活NF-κB的刺激存在的情况下，IκB-α会在Ser32和Ser36被磷酸化，随后被泛素-蛋白酶体途径降解。
NF-κB和IκB-α解聚后，其核定位序列被暴露，从而被转运到细胞核内促进NF-κB依赖的基因转录。
通过免疫染色检测NF-κB的主要亚基p65是否被转移到细胞核内，就可以判断NF-κB是否被激活.本NF-κB激活－核转运检测试剂盒仅染色p65，不染色RelB、C-Rel、p50和p52。
使用本试剂盒染色后NF-κB呈红色荧光，细胞核呈蓝色荧光.思考信号转导和检测的理论我做了这样的回答(个人意见.大家可以讨论!):这种理论上来讲可行,但是实际操作可能拿不到你想要得结果,原因很简单,凭染色来判断是很难区分程度上的差异的,就比如做WB实验,经典的还是化学发光的方法,显色的方法只能得到信号比较强的蛋白,遇到信号比较弱的蛋白就误差很大了, 第二点,并不是所有能进核的蛋白都有结合DNA的能力,如果结合了那才是真正的参与转录的转炉银子, 有的入核后却不能和DNA结合,只能等着被降解!其实总体而言大家做试验时都希望成功,但是EMSA试验技术的独特性和复杂性决定了,要想做成功EMSA试验,拿到阳性结果可总结为一句话: 把握整体,注意细节!我觉的EMSA的整体性包括6大点:探针制备(设计,合成,标记,纯化,退火);个人实验设计(时间剃度浓度查阅文献等);核蛋白制备;浓度测定;EMSA操作;实验时竞争设计. 这六大点都是会直接影响到EMSA试验的成功与否! 中间就必须注意到这六大点的细节,包括操作细节,在这点上,我倒是很佩服美国佬的态度,我记得3.5年那几个美国佬给我培训的试验技术的时候就严格的按照他们的规定每一个细节操作,并养成一个实验习惯; 比如其中的一点:他们培训我们在配置溶液的时候只要是液体的东西无论什么养成一个习惯就是摇一摇,因为有些溶液静止时间长了有效的大颗粒可能下沉,要是直接取会造成不均匀的误差,到时候试验结果出了问题,很难推断操作错误的地方,养成一个习惯即使是蒸馏水也摇一摇,呵呵,倒不是说的这么夸张,但强调的是一个严格而良好的试验习惯! 呵呵,言归正传,实验技术毕竟是一门动手性很强的科学,理论还是和动手还是有一定差别的, 希望我的一些理论能给大家帮助.下面我大概的介绍一下EMSA的一些理论和自己试验的心得,以便站友学习, 另外,EMSA是一个很大的试验.我一时间也不能把所有的都罗列出来,只能等大家遇到问题,只要我有时间在线就尽力帮忙交流, 呵呵 ! 我做的最多的还是NFKB,此外还有AP-1,STAT3,STAT5,HIF等,希望能于大家交流.简介:EMSA ( Electrophoretic Mobility Shift Assay ) 凝胶迁移实验是一种研究DNA与蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的常用技术。
凝胶迁移实验 碧云天
EMSA探针生物素标记试剂盒产品编号产品名称包装GS008 EMSA探针生物素标记试剂盒 20次产品简介：¾EMSA探针生物素标记试剂盒(EMSA Probe Biotin Labeling Kit)是一种通过Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT)把生物素标记的dUTP添加到单链DNA 3’末端，然后通过退火产生生物素标记的EMSA探针的试剂盒。
通常DNA的3’末端被标记后不会干扰基于序列特异性蛋白结合的EMSA检测。
¾Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT)可以在不依赖于模板的情况下催化在DNA的3’-OH端加上dNTP的反应。
关于TdT催化双链DNA末端加dNTP的反应效率，3’端突出的双链DNA要比平端或3’端缩进的双链DNA高很多。
TdT催化单链DNA末端加dNTP的反应效率要比双链DNA高很多。
在适当的条件下，TdT也可以催化RNA 3’末端加NTP的反应。
¾本试剂盒适合标记纯化的单链DNA，如果用于标记EMSA探针，可以在单链标记后再进行退火。
¾本试剂盒中提供了已经用生物素标记好的Biotin-Control Oligo，可以用作检测DNA标记效率的对照。
¾如果每个标记反应的探针量为5pmol，本试剂盒可以用于20个标记反应。
包装清单：产品编号产品名称包装GS008-1 TdT Buffer (5X) 250µlGS008-2TdT (10U/µl)20µlGS008-3Biotin-11-dUTP (5µM)100µlGS008-4Biotin-Control Oligo (0.4µM)100µlGS008-5 Ultrapure water 1mlGS008-6 探针标记终止液200µlGS008-7 TE 15mlGS008-8 退火缓冲液(10X) 150µl—说明书1份保存条件：-20℃保存。
EMSA实验方案(LightShift
EMSA实验方案(LightShiftEMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）是一种常用的方法，用于研究DNA与蛋白质的相互作用。
其中的LightShift EMSA实验方案结合了EMS（Electrophoretic Mobility Shift）技术和特殊的标记技术，可以用来检测DNA与蛋白质的结合，并研究其结合位点、结合亲和性以及识别新的结合蛋白等。
以下是LightShift EMSA实验方案的详细步骤：1.DNA质粒制备：从菌落中挑出含有目标DNA或合成的DNA片段的细菌，并进行PCR扩增。
通过酶切方法，将目标DNA切割并提取。
使用琼脂糖凝胶电泳检测切割效果，然后进行纯化并定量。
2.DNA标记：使用合适的DNA标记试剂盒，将目标DNA进行标记。
常用的标记方法包括放射性标记，如32P标记，或非放射性标记，如荧光标记、生物素标记等。
3.蛋白质提取：从细胞提取目标蛋白质，通过抑制剂和洗涤缓冲液可以避免蛋白质降解和保持其活性。
使用草履虫虫酶或超声波破碎等方法破坏细胞膜，并将蛋白质溶于提取缓冲液中。
4.EMSA反应：在一个反应管中，将标记的DNA与蛋白质混合，然后加入适量的电泳缓冲液和其他成分。
根据实验需要，可以添加特定的抑制剂或其他化合物。
混合物进行孵育反应。
5.凝胶电泳：将反应混合物分别装入聚丙烯酰胺凝胶槽中，进行凝胶电泳。
使用含有缓冲液的凝胶槽，在适当的电压下进行电泳，使DNA和蛋白质分别根据其电荷、大小和结构在凝胶中迁移。
6.显影与分析：根据标记的方式，选择合适的显影方法。
如果使用放射性标记，可以使用X射线底片显影；如果使用非放射性标记，可以使用荧光标记物激发和检测。
通过观察DNA迁移位置和据对比组进行分析，判断是否有蛋白质结合的迁移带。
7.重复实验与数据分析：重复以上实验步骤，以确保结果的重复性和可靠性。
通过对不同条件下的实验数据进行统计学分析，计算结合率和蛋白质与DNA结合的亲和性。
(完整版)EMSA实验流程
1、细胞核蛋白抽提细胞：1.1 在EP管中准备单细胞混悬液1.2 进行4度，500g离心后去上清 (离心后细胞体积不得超过250 ul)。
1.3 加入150 ul NucBuster Reagent 1 /50 ul 细胞体积（按照细胞体积进行试剂比例调整），重悬细胞（1.5 ml 离心管）。
1.4 震荡混匀15秒，冰上静置5分钟（重复两次）。
1.5 进行 4度16000g 离心后去上清（上清为细胞质组分）。
1.6（可选细胞质清洗步骤）加入500 ul 预冷PBS缓冲液重悬、离心、去上清。
1.7 每50ul细胞体积，按比例加入预先混合的（1ul 复合蛋白抑制酶（100X），1ul 100mM DTT 以及75 ul NucBuster Extraction Reagent 2），进行重悬。
1.8 震荡15秒，冰上静置 5分钟（重复两次）。
1.9 进行4度16000g离心后，将上清转移至新的1.5ml离心管（此上清为细胞核组分）。
此上清可立即用于EMSA实验，或分装后存放于-80度。
组织：1.1 用液氮将组织磨碎，将组织收集到EP管中，根据组织体积按比例加入NucBuster Reagent 1试剂，利用枪头重悬组织。
1.2 震荡混匀15秒，冰上静置5分钟（重复两次）。
1.3 进行 4度16000g 离心后去上清。
1.4 下同细胞部分的1.3-1.92、探针合成与标记2.1 正反配对并包含转录因子结合位点的两条生物素标记的引物进行退火反应，得到25 uM （未标记）或 1 uM （标记）终浓度双链引物，-20度保存备用。
使用NEB2 buffer，在PCR仪或者加热块上进行，98度5分钟，逐渐冷却至室温即可。
3、4-6% 非变性EMSA胶（0.5 X TBE）配置注意事项：必须采用非变性胶（即不能加入SDS等变性试剂），并需采用TBE 缓冲液。
凝胶配置详见凝胶试剂盒说明书。
4、EMSA结合反应注意事项：按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入热探针前先混匀，避免剧烈震荡，并且室温放置10分钟，从而消除可能发生的探针与蛋白的非特异性结合，并且让冷探针优先反应，然后加入热探针（或对应抗体），混匀，室温放置20分钟。
EMSA实验流程(可编辑修改版).
1、细胞核蛋白抽提细胞：1.1 在EP管中准备单细胞混悬液1.2 进行4度，500g离心后去上清 (离心后细胞体积不得超过250 ul)。
1.3 加入150 ul NucBuster Reagent 1 /50 ul 细胞体积（按照细胞体积进行试剂比例调整），重悬细胞（1.5 ml 离心管）。
1.4 震荡混匀15秒，冰上静置5分钟（重复两次）。
1.5 进行 4度16000g 离心后去上清（上清为细胞质组分）。
1.6（可选细胞质清洗步骤）加入500 ul 预冷PBS缓冲液重悬、离心、去上清。
1.7 每50ul细胞体积，按比例加入预先混合的（1ul 复合蛋白抑制酶（100X），1ul 100mM DTT 以及75 ul NucBuster Extraction Reagent 2），进行重悬。
1.8 震荡15秒，冰上静置 5分钟（重复两次）。
1.9 进行4度16000g离心后，将上清转移至新的1.5ml离心管（此上清为细胞核组分）。
此上清可立即用于EMSA实验，或分装后存放于-80度。
组织：1.1用液氮将组织磨碎，将组织收集到EP管中，根据组织体积按比例加入NucBuster Reagent 1试剂，利用枪头重悬组织。
1.2震荡混匀15秒，冰上静置5分钟（重复两次）。
1.3进行 4度16000g 离心后去上清。
1.4下同细胞部分的1.3-1.92、探针合成与标记2.1 正反配对并包含转录因子结合位点的两条生物素标记的引物进行退火反应，得到25 uM （未标记）或 1 uM （标记）终浓度双链引物，-20度保存备用。
使用NEB2 buffer，在PCR仪或者加热块上进行，98度5分钟，逐渐冷却至室温即可。
3、4-6% 非变性EMSA胶（0.5 X TBE）配置10 X TBE buffer (PH = 8.3) 1 ml30% Acr-Bis gel 4 ml80% glycerol 0.625 mlH2O14.375 ml10% APS 0.3 mlTEMED 20 ultotal 20 ml注意事项：必须采用非变性胶（即不能加入SDS等变性试剂），并需采用TBE缓冲液。
化学发光法EMSA试剂盒
BeyoECL Plus Reagent A BeyoECL Plus Reagent B Streptavidin-HRP Conjugate
封闭液 洗涤液(5X) 检测平衡液
说明书
包装 200µl 200µl 200µl 55ml 55ml 100µl 380ml 250ml 250ml 1份
保存条件：
GS009-1至GS009-3和GS009-6在-20℃保存，其余可4℃保存。如果长期不用，整个试剂盒可-20℃保存，-20℃可以保存更 长时间。
注意事项： ¾ 需自备带正电荷尼龙膜，以及凝胶电泳时所需的相关试剂。带正电荷尼龙膜(FFN12/FFN16)可以向碧云天订购。
¾ 如果需要使用更多的封闭液或洗涤液，可另外单独订购GS009B封闭液或GS009W洗涤液(5X)。 ¾ 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
6. 转膜： A. 取一和EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜，剪角做好标记，用0.5XTBE浸泡至少10分钟。尼龙膜自始至终仅能使用镊 子夹取，并且仅可夹取不可能接触样品的边角处。 B. 取两片和尼龙膜大小相近或略大的滤纸，用0.5XTBE浸湿。 C. 把浸泡过的尼龙膜放置在一片浸湿的滤纸上，注意避免尼龙膜和滤纸间产生气泡。 D. 非常小心地取出EMSA胶放置到尼龙膜上，注意确保胶和膜之间没有气泡。 E. 再把另外一片浸湿的滤纸放置到EMSA胶上，注意确保滤纸和胶之间没有气泡。 F. 采用Western时所使用的湿法电转膜装置或其它类似的电转膜装置，以0.5XTBE为转膜液，把EMSA胶上的探针、蛋白 以及探针和蛋白的复合物等转移到尼龙膜上。对于大小约为10x8x0.1cm的EMSA胶，用BioRad的常用的Western转膜
pierce EMSA 试剂盒说明书
INSTRUCTIONSNumberDescription20148 LightShift Chemiluminescent EMSA Kit , contains components for 100 binding reactions and sufficient detection reagents for approximately 1000cm 2 of membrane Kit Contents:10X Binding Buffer , 1mL, 100mM Tris, 500mM KCl, 10mM DTT; pH 7.5, store at -20°C Biotin–EBNA Control DNA , 50μL , 10fmol/μL in 10mM Tris, 1mM EDTA; pH 7.5, store at -20°CThe 60 bp biotin end-labeled duplex contains the following binding site:5' BIOTIN-...TAGCATATGCTA (3)3'-…ATCGTATACGAT…-BIOTIN 5'Unlabeled EBNA DNA , 50μL , 2pmol/μL in 10mM Tris, 1mM EDTA; pH 7.5, store at -20°CThe ~25 bp duplex contains the following binding site:5'-...TAGCATATGCTA (3)3'-...ATCGTATACGAT (5)Epstein-Barr Nuclear Antigen (EBNA) Extract , 125μL , store at -20°C Poly (dI•dC), 125μL , 1µg/μL in 10mM Tris, 1mM EDTA; pH 7.5, store at -20°C 50% Glycerol , 500μL , store at -20°C 1% NP-40, 500μL , store at -20°C 1 M KCl , 1mL, store at -20°C 100mM MgCl 2, 500μL , store at -20°C 200mM EDTA pH 8.0, 500μL , store at -20°C5X Loading Buffer , 1mL, store at -20°CStabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate , 1.5mL, store at 4°C Chemiluminescent Substrate, stable for 6 months at room temperature or 1 year at 4°C Luminol/Enhancer Solution , 80mLStable Peroxide Solution , 80mLBlocking Buffer , 500mL, store at 4°C 4X Wash Buffer , 500mL, store at 4°CSubstrate Equilibration Buffer , 500mL, store at room temperature or 4°CStorage : Upon receipt store individual components as indicated above. Box 20148X is shipped with dry ice. Box 89880 is shipped with an ice pack.LightShift ®Chemiluminescent EMSA KitTable of ContentsIntroduction (2)Procedure for Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) (3)A. Plan Binding Reactions (3)B. Prepare and Pre-Run Gel (4)C. Prepare and Perform Binding Reactions (5)D. Electrophorese Binding Reactions (5)E. Electrophoretic Transfer of Binding Reactions to Nylon Membrane (5)F. Crosslink Transferred DNA to Membrane (5)G. Detect Biotin-labeled DNA by Chemiluminescence (6)Additional Information Available from the Pierce Web Site (6)Troubleshooting (7)Related Thermo Scientific Products (7)References (8)IntroductionThe electrophoretic mobility shift assay (EMSA) has been used extensively for studying DNA-protein interactions.1-3 This technique is based on the fact that DNA-protein complexes migrate slower than non-bound DNA in a native polyacrylamide or agarose gel, resulting in a “shift” in migration of the labeled DNA band.The Thermo Scientific LightShift Chemiluminescent EMSA Kit uses a nonisotopic method to detect DNA-protein interactions. Biotin end-labeled DNA containing the binding site of interest is incubated with a nuclear extract or purified factor. This reaction is then subjected to gel electrophoresis on a native polyacrylamide gel and transferred to a nylon membrane. The biotin end-labeled DNA is detected using the Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate and the Chemiluminescent Substrate.Additional Materials Required•Biotin 3' or 5' end-labeled DNA target. Use existing end-biotinylated DNA targets or prepare them using a biotin end-labeling kit (see Related Thermo Scientific Products). Do not use probes with internal biotin labels (i.e., targetsbiotinylated at sites other than the 3' or 5' end, such results from random prime labeling methods) because the internal labels may inhibit binding of the DNA binding protein.•Positively charged nylon membrane (see Related Thermo Scientific Products)•5X TBE (450mM Tris, 450mM boric acid, 10mM EDTA, pH 8.3)•X-ray film (see Related Thermo Scientific Products) or CCD camera•UV lamp or crosslinking device equipped with 254nm bulbs or 312nm transilluminator•Electrophoresis apparatus•Electroblotter or capillary transfer apparatus•High-quality blotting paper•Circulating water bath•Plastic forceps•Polyacrylamide gel in 0.5X TBEProcedure for Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)This kit has been optimized for use with polyacrylamide mini (8 × 8 × 0.1cm) gels. For larger gels, adjust electrophoresis conditions and detection reagent volumes accordingly.A.Plan Binding Reactions•Understanding the Control EBNA SystemInclude a complete set of three reactions each time an EMSA is performed. These reactions and expected results for the Control Epstein-Barr nuclear antigen(EBNA) System, which is included with the kit, are described in Table 1.The Control EBNA System results reported in Table 1 were generated using binding reactions prepared according to Table 2. Each 20μL binding reaction contains 20 fmol of Biotin-EBNA Control DNA. Reactions were electrophoresed, transferred and detected according to the steps in Sections B-G of this protocol. If the kit is being used for the first time, perform the Control EBNA System reactions to verify that the kit components and overall procedure are working properly.Table 2. Binding reactions for Control EBNA System.Component Final AmountControl Reactions#1 #2 #3Ultrapure Water ---- 12μL11μL9μL 10X Binding Buffer (20148A) 1X 2μL2μL2μL 50% Glycerol (20148F) 2.5% 1μL1μL1μL 100mM MgCl2 (20148I) 5mM 1μL1μL1μL 1µg/μL Poly (dI•dC) (20148E)50 ng/µL 1μL1μL1μL 1% NP-40 (20148G) 0.05% 1μL1μL1μL Unlabeled EBNA DNA (20148C) 4 pmol ----- ----- 2μL EBNA Extract (20148D) 1 Unit ----- 1μL1μL Biotin–EBNA Control DNA (20148B) 20 fmol 2μL2μL2μL Total Volume ---- 20μL20μL20μL•Planning and optimizing the Test SystemAs with the Control EBNA System, a complete set of three reactions should be performed with the Test System. Use Table 3 as a guide for planning the Test System binding reactions. If specific binding conditions are not already known, use only minimal reaction components; e.g., 10X binding buffer and Poly (dΙ•dC), together with the biotin-labeled target DNA, protein extract and unlabeled DNA of the Test System.Nuclear protein extracts prepared using the Thermo Scientific NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents (see Related Thermo Scientific Products) are an excellent source of target protein. Use 2-3μL of NE-PER®Nuclear Extract per 20μL binding reaction. If a greater volume of NE-PER Extract is required, remove excess salts in the extract by dialyzing into a buffer containing 200mM salt (use a Slide-A-Lyzer®MINI Dialysis Unit; see Related Thermo Scientific Products) before use in the LightShift EMSA Kit.Optimization of the Test System can be achieved by adding other components supplied in the kit such as KCl,4, 5 glycerol, MgCl24, 6 and detergent 7, 8and determining their effects on the shift. Bovine serum albumin and basic peptides have also been shown to enhance some DNA-protein interactions.8-10 Too much glycerol in the binding reactions may cause vertical streaks along the edges of the lanes.Poly (dI•dC), which is included in the kit, is the no nspecific competitor DNA of choice for most systems. However if the Test System target DNA sequence is GC-rich, try Poly (dA•dT), sonicated calf thymus, salmon sperm or Escherichia coli DNA. The order of addition of the nuclear extract and biotin-labeled target DNA may affect the specificity of the DNA-protein complexes. Always add the binding reaction components in the order listed in Table 3. To overcome strong nonspecific interactions, a short pre-incubation may be required before adding the biotin-labeled target DNA.Table 3. Binding reactions for the Test System.B.Prepare and Pre-Run Gel1.Prepare a native polyacrylamide gel in 0.5X TBE or use a pre-cast DNA retardation gel. The appropriate polyacrylamidepercent depends on the size of the target DNA and the binding protein. Most systems use a 4 -6% polyacrylamide gel in0.5X TBE.2.Place the gel in the electrophoresis unit, and clamp it to obtain a seal. Fill the inner chamber with 0.5X TBE to a heightseveral millimeters above the top of the wells. Fill the outside of the tank with 0.5X TBE to just above the bottom of the wells, which reduces heat during electrophoresis. Flush wells and pre-electrophorese the gel for 30-60 minutes. Apply 100V for an 8 × 8 × 0.1cm gel.3.Proceed to Section C while gel is pre-electophoresing.C.Prepare and Perform Binding ReactionsNotes:•Include controls in the assay to ensure the system is working properly (see Procedure, Section A).•Do not vortex the Control DNA or the EBNA extract.1.Thaw all binding reaction components, EBNA Control System components and Test System samples, and place them onice. Do not thaw the EBNA Extract until immediately before use. Thaw the EBNA Extract at room temperature. DO NOT heat the EBNA Extract, which includes thawing in your hand.2.Prepare complete sets of 20 binding reactions for the Control EBNA System and/or the Test System according toProcedure Section A, Tables 2 and 3; add the reagents in the order listed in the tables. Do not vortex tubes at any time during this procedure.3.Incubate binding reactions at room temperature for 20 minutes.4.Add 5µL of 5X Loading Buffer to each 20µL binding reaction, pipetting up and down several times to mix. DO NOTvortex or mix vigorously.D.Electrophorese Binding Reactions1.Switch off current to the electrophoresis gel.2.Flush the wells and then load 20μL of each sample onto the polyacrylamide gel.3.Switch on current (set to 100V for 8 × 8 × 0.1cm gel) and electrophorese samples until the bromophenol blue dye hasmigrated approximately 2/3 to 3/4 down the length of the gel. The free biotin-EBNA Control DNA duplex migrates just behind the bromophenol blue in a 6% polyacrylamide gel.E.Electrophoretic Transfer of Binding Reactions to Nylon Membrane1.Soak nylon membrane in 0.5X TBE for at least 10 minutes.2.Sandwich the gel, nylon membrane and blotting paper in a clean electrophoretic transfer unit according themanufacturer’s instructions. Use 0.5X TBE cooled to ~10ºC with a circulating water bath. Use very clean forceps and powder-free gloves, and handle the membrane only at the corners.Note: Use clean transfer sponges. Avoid using sponges that have been used in Western blots.3.Transfer at 380mA (~100V) for 30 minutes. Typical transfer times are 30-60 minutes at 380mA using a standard tanktransfer apparatus for mini gels (8 × 8 × 0.1cm).4.When the transfer is complete, place the membrane with the bromophenol blue side up on a dry paper towel. (Thereshould be no dye remaining in the gel.) Allow buffer on the membrane surface to absorb into the membrane. This will only take a minute. Do not let the membrane dry. Immediately proceed to Section F.F.Crosslink Transferred DNA to MembraneThree options are available for crosslinking:•Option 1: Crosslink at 120mJ/cm2using a commercial UV-light crosslinking instrument equipped with 254nm bulbs (45-60 second exposure using the auto crosslink function).•Option 2: Crosslink at a distance of approximately 0.5 cm from the membrane for 5-10 minutes with a hand-held UV lamp equipped with 254nm bulbs.•Option 3: Crosslink for 10-15 minutes with the membrane face down on a transilluminator equipped with 312nm bulbs. After the membrane is crosslinked, proceed directly to Section G. Alternatively, the membrane may be stored dry at room temperature for several days. Do not allow the membrane to get wet again until ready to proceed with Section G.G.Detect Biotin-labeled DNA by ChemiluminescenceThe recommended volumes are for an 8 × 10cm membrane. If larger gels are used, adjust volumes in Section G accordingly. Perform all blocking and detection incubations in clean trays or in plastic weigh boats on an orbital shaker.1.Gently warm the Blocking Buffer and the 4X Wash Buffer to 37-50°C in a water bath until all particulate is dissolved.These buffers may be used between room temperature and 50°C as long as all particulate remains in solution. The Substrate Equilibration Buffer may be used between 4°C and room temperature.2.To block the membrane add 20mL of Blocking Buffer and incubate for 15 minutes with gentle shaking.3.Prepare conjugate/blocking buffer solution by adding 66.7μL Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugateto 20mL Blocking Buffer (1:300 dilution).Note: This conjugate/blocking buffer solution has been optimized for the Nucleic Acid Detection Module and should not be modified.4.Decant blocking buffer from the membrane and replace it with the conjugate/blocking solution. Incubate membrane inthe conjugate/blocking buffer solution for 15 minutes with gentle shaking.5.Prepare 1X wash solution by adding 40mL of 4X Wash Buffer to 120mL of ultrapure water.6.Transfer membrane to a new container and rinse it briefly with 20mL of 1X wash solution.7.Wash membrane four times for 5 minutes each in 20mL of 1X wash solution with gentle shaking.8.Transfer membrane to a new container and add 30mL of Substrate Equilibration Buffer. Incubate membrane for5 minutes with gentle shaking.9.Prepare Substrate Working Solution by adding 6mL Luminol/Enhancer Solution to 6mL Stable Peroxide Solution.Note: Exposure to the sun or any intense light can harm the Working Solution. Keep the Working Solution in an amber bottle and avoid prolonged exposure to intense light. Short-term exposure to typical laboratory lighting will not harm the Working Solution.10.Remove membrane from the Substrate Equilibration Buffer, carefully blotting an edge of the membrane on a paper towelto remove excess buffer. Place membrane in a clean container or onto a clean sheet of plastic wrap placed on a flat surface.11.Pour the Substrate Working Solution onto the membrane so that it completely covers the surface. Alternatively, themembrane may be placed DNA side down onto a puddle of the Working Solution. Incubate membrane in the substrate solution for 5 minutes without shaking.12.Remove membrane from the Working Solution and blot an edge of the membrane on a paper towel for 2-5 seconds toremove excess buffer. Do not allow the membrane to become dry.13.Wrap the moist membrane in plastic wrap, avoiding bubbles and wrinkles.14.Expose membrane to an appropriately equipped CCD camera, or place the membrane in a film cassette and expose toX-ray film for 2-5 minutes. Develop the film according to manufacturer’s instructions. Exposure time may be adjusted to obtain the desired signal.Additional Information Available from our Website•Tech Tip: Anneal complementary pairs of oligonucleotides•Frequently Asked Questions (FAQ) for the LightShift Chemiluminescent EMSA KitRelated Thermo Scientific Products89818 Biotin 3' End DNA Labeling Kit, components for 20 labeling reactions78833 NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents77016 Biodyne B Nylon Membrane, 8cm × 12cm, 0.4µm pore size, 25 sheets per package 34090 CL-Xposure™ Film (5” × 7” sheets), 100 sheets per package21065 Pierce® Background Eliminator Kit, for eliminating background from X-ray film 69550 Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Unit, 10-100µL capacity, 3.5K MWCO, 50 per package 89880 Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module20158 LightShift Chemiluminescent RNA EMSA (REMSA) KitCited References1.Fried, M. and Crothers, D.M. (1981). Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacylamide gel electrophoresis. Nucl. AcidsRes. 9:6505-25.2.Revzin, A. (1989). Gel electrophoresis assays for DNA-protein interactions. BioTechniques 7:346-54.3.Hendrickson, W. (1985). Protein-DNA interactions studied by the gel electrophoresis-DNA binding assay. BioTechniques 3:198-207.4.Winston, R.L., et al. (1999). Characterization of the DNA binding properties of the bHLH domain of deadpan to single and tandem sites. Biochemistry38:5138-46.5.Triplett, B. (1992). Salt-dependent formation of DNA-protein complexes in vitr o, as viewed by the gel mobility shift assay. BioTechniques 13:354-5.6.Szczelkun, M.D. and Connolly, B.A. (1995). Sequence-specific binding of DNA by the EcoRV restriction and modification enzymes with nucleic acidand cofactor analogues. Biochemistry 34:10724-33.7.Hodgson, J. and Enrietto, P.J. (1995). Constitutive and inducible kappa B binding activities in the cytosol of v-Rel-transformed lymphoid cells. J.Virol. 69:1971-9.8.Zhang, X.Y., et al. (1992). Increasing the activity of affinity-purified DNA binding proteins by adding high concentrations of nonspecific proteins.Anal. Biochem. 201:366-74.9.Kozmik, Z., et al. (1990). Albumin improves formation and detection of some specific protein-DNA complexes in the mobility shift assay. Nucl. AcidsRe s. 18:2198.10.Bannister, A. and Kouzarides, T. (1992). Basic peptides enhance protein-DNA interaction in vitro. Nucl. Acids Re s. 20:3523.11.Sambrook, J., et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press.12.Kironmai, K.M., et al. (1998). DNA-binding activities of Hop1 protein, a synaptonemal complex component from Saccharomyces cerevisia e. Mol.Cell Biol. 18:1424-35.Product ReferencesCornelussen, R.N.M., et al. (2001). Regulation of prostaglandin A1-induced heat shock protein expression in isolated cardiomyocytes. J. Mol. Cell Cardiol.33:1447-54.Ishida, A., et al. (2002). Transforming growth factor-β induces expression of receptor activator of NF-κB ligand in vascular endothelial cells derived from bone. J. Biol. Chem. 277(29):26217-24.MacLachlan, T.K. and El-Deiry, W.S. (2002). Apoptotic threshold is lowered by p53 transactivation of caspase-6. PNAS. 99(14):9492-7.Matata, B.M. and Galinanes, M. (2002). Peroxynitrite is an essential component of cytokines production mechanism in human monocytes through modulation of nuclear factor-κB DNA binding activity. J. Biol. Chem. 277(3):2330-5.Sauzeau, V., et al. (2003). RhoA expression is controlled by nitric oxide through cGMP-dependent protein kinase activation. J. Biol. Chem. 278(11):9472-80.Tarumi, T., et al. (2002). Cloning and characterization of the human factor XI gene promoter. J. Biol. Chem. 277(21):18510-16.Biodyne® is a registered trademark of Pall BioSupport Corporation.This product (“Product”) is warranted to operate or perform substantially in conformance with published Product specifications in effect at the time of sale, as set forth in the Product documentation, specifications and/or accompanying package inserts (“Documentation”) and to be free from defects in material and workmanship. Unless otherwise expressly authorized in writing, Products are supplied for research use only. No claim of suitability for use in applications regulated by FDA is made. The warranty provided herein is valid only when used by properly trained individuals. Unless otherwise stated in the Documentation, this warranty is limited to one year from date of shipment when the Product is subjected to normal, proper and intended usage. This warranty does not extend to anyone other than the original purchaser of the Product (“Buyer”).No other warranties, express or implied, are granted, including without limitation, implied warranties of merchantability, fitness for any particular purpose, or non infringement. Buyer’s exclusive remedy for non-conforming Products during the warranty period is limited to replacement of or refund for the non-conforming Product(s).There is no obligation to replace Products as the result of (i) accident, disaster or event of force majeure, (ii) misuse, fault or negligence of or by Buyer, (iii) use of the Products in a manner for which they were not designed, or (iv) improper storage and handling of the Products.Current product instructions are available at /pierce. For a faxed copy, call 800-874-3723 or contact your local distributor.© 2011 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. Unless otherwise indicated, all trademarks are property of Thermo Fisher Scientific Inc. and its subsidiaries. Printed in the USA.。
EMSA 操作说明
Procedure for Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)This kit has been optimized for use with polyacrylamide mini (8 × 8 × 0.1cm) gels. For larger gels, adjust electrophoresisconditions and detection reagent volumes accordingly.A. Plan Binding ReactionsB．准备与预电泳1.用0.5XTBE准备非变性的聚丙烯酰胺凝胶或预制的DNA阻滞凝胶。
适当的凝胶浓度依赖于DNA和连接蛋白的大小。
大部分系统用4~6%的聚丙烯凝胶。
2.将胶放于电泳设备并将其固定。
注入0.5XTBE，距顶部数毫米。
电泳槽外边注入0.5XTBE，高于容器的底部，通过此来降低电泳时的温度。
冲洗容器并对胶进行30~60分钟的预电泳。
8 × 8 × 0.1cm 的胶需要100V电压。
3.胶进行预电泳并进行C部分。
C．准备并完成结合反应注：注意A部分的内容以确定系统工作的正常。
1.在冰中融化结合反应各试剂，EBNA控制系统的各试剂和实验样本。
避免DNA探针的过度加温。
EBNA提取物直到用时在融化。
2.按照A部分的表2和3为EBNA控制系统and/or实验系统准备完整的20 µl反应体系。
3.在室温孵育结合反应液20分钟。
4.每个20 µl反应体系中添加5 µl的5X Loading Buffer，并吹打数分钟以充分混匀。
不能涡旋或剧烈混合。
D．电泳移动结合反应1.却断凝胶电泳的电源；2.冲洗，每样本加入20 µl到凝胶上；3.开启电流(set to 100 V for 8 × 8 × 0.1cm gel)，电泳样本直到溴酚蓝跑过凝胶总长度的2/3到3/4时。
碧云天 EMSA试剂盒[1]
![碧云天 EMSA试剂盒[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/3a2fb01e227916888486d7fb.png)
TBE buffer (10X) 重蒸水
1.0ml 16.2ml
39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v) 80% 甘油 10% 过硫酸铵(ammonium persulfate)
2ml 625µl 150µl
TEMED
10µl
C. 按照上述顺序依次加入各种试剂，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避
装置，电转时可以设置为380mA(约100V)转膜30-60分钟。如果胶较厚，则需适当延长转膜时间。转膜时需保持转膜 液的温度较低，通常可以把电转槽置于4℃冷库或置于冰浴或冰水浴中进行电转，这样可以确保低温。具体的电转膜 方法请参考电转膜装置的使用说明。 G. 转膜完毕后，小心取出尼龙膜，样品面向上，放置在一干燥的滤纸上，轻轻吸掉下表面明显的液体。立即进入下一 步的交联步骤，不可使膜干掉。 7. 交联： A. 用紫外交联仪(UV-light cross-linker)选择254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联45-60秒。如果没有紫外交联仪可以使用普 通的手提式紫外灯(例如碧云天的手提紫外检测仪(EUV002))，距离膜5-10厘米左右照射3-10分钟。也可以使用超净工 作台内的紫外灯，距离膜5-10厘米左右照射3-15分钟。最佳的交联时间可以使用标准品自行摸索。 B. 交联完毕后，可以直接进入下一步检测；也可以用保鲜膜包裹后在室温干燥处存放3-5天，然后再进入下一步检测。 如果检测结果发现交联效果不佳，甚至连free probe的条带都非常微弱，可以考虑在膜干燥后参考步骤A的条件再交联 一次，以进一步改善交联效果。 8. 化学发光法检测生物素标记的探针： A. 37-50℃水浴溶解封闭液和洗涤液。 注意：封闭液和洗涤液必须完全溶解后方可使用，封闭液和洗涤液可以在室温至50℃之间使用，但必须确保这两种 溶液中均无沉淀产生，在冬天需特别注意。 B. 取一合适的容器加入15ml封闭液，再放入交联过的含有样品的尼龙膜。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。 C. 取7.5µl Streptavidin-HRP Conjugate加入到15ml封闭液中(1:2000稀释)，混匀备用。 D. 去除用于尼龙膜封闭的封闭液，加入上一步中配制的15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封闭液。在侧摆摇床或水 平摇床上缓慢摇动15分钟。 E. 取25ml洗涤液(5X)，加入100ml重蒸水或MilliQ级纯水，混匀配制成125ml洗涤液。 F. 将尼龙膜转移至另一装有15-20ml洗涤液的容器内，漂洗1分钟。 G. 去除洗涤液，加入15-20ml洗涤液，在侧摆摇床或水平摇床缓慢上洗涤5分钟。 H. 重复步骤G 三次(共洗涤四次)，每次洗涤时间都约为5分钟。 I. 将尼龙膜转移至另一装有20-25ml检测平衡液的容器内，在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动5分钟。 J. 取5ml BeyoECL Plus Reagent A和5ml BeyoECL Plus Reagent B混匀，配制成BeyoECL Plus Reagent工作液。注意： BeyoECL Plus Reagent工作液必须现配现用。说明：从本步骤起操作方法和注意事项同Western实验的荧光检测。 K. 取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。立即将膜的样品面向上，放置到处于水平桌面上的洁净容器内或保鲜膜上。 L. 在尼龙膜的表面小心加上步骤J配制好的共10ml BeyoECL Plus Reagent工作液，使工作液完全覆盖尼龙膜。室温放置 2-3分钟。 M. 取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。将尼龙膜放在两片保鲜膜或其它适当的透光薄膜中间，并固定于压片暗盒(也 称片夹)内。 N. 用X光片压片1-5分钟。可以先压片1分钟，立即显影定影，然后根据结果再调整压片时间；也可以直接分别压片30 秒、1、3、5分钟或更长时间，然后一起显影定影观察结果。
EMSA示意图
凝胶滞缓实验(Gel retardation assay)，又称DNA迁移率变化试验(DNA mobility shiftassay--EMSA接上贴如《现代分子生物学实验技术》该书中就有详细介绍说明，高等教育出版社出版，卢圣栋主编。
若找不到该书，一般有关分子生物的实验技术书上都会有介绍。
总的说来，EMSA不是太好做，目前有两种方法，一种是有放射性同位素标记的，还有一种是不用同位素的，采用的化学发光的方法。
因为它的影响因素很多，有抗体的浓度，一些离子的强度和实验的条件等等，如果要做出好的EMSA的结果需要摸条件。
我们采用的是化学的方法，总的来说没有同位素的方法经典。
感觉一般的书介绍的都比较粗略，最好查阅相关要作的分子已发表papae的实验条件，在此基础上再不断的摸索。
分子克隆第三版上也有相关的知识。
如果要买公司的试剂盒的话，可在网上查阅相关的信息。
以上仅为我之拙见。
推荐一个很好的EMSA试剂相关网站，可以参考。
另外，现在有新的方法定量检测活性转录因子含量，类似于ELISA的方法，只是板子上包被的是寡核苷酸，操作很简单，效果也比较好，可以参考。
promega 公司有专门做NF-kB活性的试剂盒，名字叫E3300，效果不错。
我参考了一些分子生物学技术参考书总结了该实验的protocol（包括核蛋白的提取过程），供您参考如下：实验材料及方法一、细胞核蛋白质的提取试剂和溶液缓冲液A 缓冲液B10mmol/L HEPES-KOH Ph7.9 20mmol/L HEPES-KOH Ph7.91.5mmol/L MgCL2 1.5mmol/L MgCL210mmol/L KCL 420mmol/L NaCL0.5mmol/L DTT 0.2mmol/L EDTA0.2mmol/L PMSF 25% Glycerol0.5mmol/L DTT0.2mmol/L PMSF操作步骤1．去细胞培养液，用PBS（含0.05mmol/LPMSF）洗两次，用刮板将细胞刮下，计数细胞，收集于适当体积离心管，用少量PBS冲洗平皿一并吸入离心管。
EMSA实验步骤
EMSA实验步骤LightShift化学发光法EMSA试剂盒试剂盒组成化学发光法EMSA优化和质控试剂盒（20148×）10×Binding Buffer，1ml，保存于-20°CBiotin-EBNA Control DNA，50μl，保存于-20°CUnlabeled EBNA DNA，50μl，保存于-20°CEpstein-Barr Nuclear Antigen(EBNA) Extract，125μl，保存于-20°CPoly(dI.dC)，125μl，保存于-20°C50%Glycerol，500μl，保存于-20°C1%NP-40，500μl，保存于-20°C1M KCl，1ml，保存于-20°C100mM Mgcl2，500μl，保存于-20°C200mM EDTA，500μl，保存于-20°C5×Loading Buffer，1ml，保存于-20°C化学发光核酸检测模块（89880）Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate，1.5ml，保存于4°C Chemiluminescent Substrate，4°C可保存1年Luminol/Enhancer Solution，80mlStable Peroxide Solution，80mlBlocking Buffer，500ml，保存于4°C4×Wash Buffer，500ml，保存于4°CSubstrate Equilibration Buffer，500ml，保存于4°CEMSA步骤A 配胶和预电泳1 用0.5×TBE配制非变性聚丙烯酰胺凝胶，大多数采用0.5×TBE 配制4-6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶2 用0.5×TBE灌注电泳槽，直至刚好没过加样孔底部。
EMSA步骤
B 准备跑预电泳1、用0.5XTBE配制聚丙烯酰胺凝胶或者使用预制的DNA凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶的浓度取决于靶DNA和结合蛋白的大小。
大部分情况下使用4-6%的胶。
2、向电泳槽中倒入0.5XTBE高于泳道底（用以减少电泳中产生的热）。
冲洗泳道并预电泳30-60mins。
对于8x8x0.1cm的胶使用100v电压即可。
3、胶预电泳过程中进行C。
C 准备进行结合反应注意：包括实验中的对照，以确保试剂盒正常发挥作用（见Section A）1、将结合反应的组分、EBNA对照组份和试验样品融化后置于冰上。
避免过度加热DNA探针。
马上要开始实验再融化EBNA提取物。
2、按照表格2和3混好20ul对照EBNA组和实验组结合体系。
3、结合体系在室温孵育20mins。
4、20ul结合体系中加入5ul的5XLoading buffer，用移液器混合几下。
动作轻柔，不要剧烈！D 结合反应产物进行电泳1、暂停预电泳。
2、冲洗泳道，每个样上20ul。
3、接通电流（8x8x0.1cm的胶使用100v电压），电泳直到溴酚蓝条带跑到胶板2/3或3/4处。
一般6%的胶上自由生物素-EBNA对照DNA双链迁移到溴酚蓝后面的位置。
E 转膜1、将尼龙膜浸泡在0.5XTBE至少10mins。
2、将胶和膜按照三明治在清洁的电泳转移装置上摆好。
在循环水浴锅中将0.5XTBE预冷到10度。
使用洁净的镊子和无粉手套，用镊子夹膜的时候只夹在边角上。
注意：使用洁净的转移海绵。
避免使用曾在Western blots用过的海绵。
3、380mA（~100V）转膜30mins。
一般情况下，使用标准转移装置以380mA转移8x8x0.1cm 的胶30-60mins即可。
4、转移结束后，将膜溴酚蓝面朝上放在干燥滤纸上（保证胶上没有染液）。
使得膜表面的buffer吸收进膜里，大概需要一分钟。
不要使膜变干。
接下来进行Section F。
F 将转移的DNA交联到膜上交联有三种方法：交联后进行Section G。
非放射性凝胶迁移试剂盒（EMSA）说明书
（1）湿转
1） 配制电转印缓冲液：配制电转印缓冲液0.5×TBE 1200ml。
10×TBE 双蒸馏水 总量
60ml 1140ml 1200ml
电转印可在室温下进行。
2） 浸膜：将结合膜，2张厚滤纸和电转印泡沫垫在0.5×TBE浸泡10分钟（注意标记加样顺序）。
3） 装配电转印夹：电泳后，慢慢从凝胶上移走一片玻璃，将凝胶与另一片玻璃一起移入装有 TBE的盒中，在让凝胶与玻璃分离，使凝胶漂浮在TBE中。取一片预湿的滤纸在TBE中移动 到凝胶板下面，小心将滤纸与凝胶对齐一起从TBE中移出，置于电转印泡沫垫上并按图示的 顺序装配电转印夹。注意凝胶板与结合膜以及与滤纸之间不能有气泡。
脱气10min 10% AP（过硫酸胺） 总量
100µl 20.0ml
注:以上组分为制作两片70×80×1.5mm聚丙烯酰胺凝胶的用量，仅供参考。
（2） 制备预冷的0.25×TBE，4ºC保存:
10×TBE 双蒸馏水 总量
30ml 1170ml 1200ml
（3） 预电泳：用预冷的0.25×TBE在冰上120V 预电泳1小时。并在上样前用电泳缓冲液冲洗 加样孔3－5次/孔。
4） 电转印：将装配好的电转印夹放入电转印槽中，在0.5×TBE中，390mA电转印40分钟。注意 电转印的电极方向不能弄错。
（2）半干转印
以美国Bio-rad（伯乐）Trans-Blot SD半干转印仪为例
1） 配制电转印缓冲液：配制电转印缓冲液0.5×TBE 200ml。
10×TBE 双蒸馏水 总量
（4） 膜洗涤： 制备1×洗涤液：
5×洗涤液 双蒸馏水 总量 (15ml×4)
12ml 48ml 60ml
10ml 190ml 200ml
化学发光法EMSA检测试剂盒
化学发光法 EMSA 检测试剂盒Chemiluminescent EMSA Detection Kit说明书修订日期： 说明书修订日期：2015.12.01 货号：KGS133 保存温度：-20℃ For Research Use Only一、产品简介 本产品是一种通过 Streptavidin-HRP 及 ECL 检测试剂来实现化学发光检测 Biotin 标记的 EMSA 探针 的检测试剂盒。
同时本试剂盒也提供 EMSA 检测所需的结合缓冲液和上样缓冲液， 及一些关键的相关试剂， 可以实现非同位素的 EMSA 检测。
本试剂盒采用了高质量的 Streptavidin-HRP Conjugate，HRP 和 Streptavidin 共价交联的比例大于 3， 这样比采用 Streptavidin 和 Biotin-HRP conjugate 两种试剂进行检测要更方便，并且灵敏度更高。
本试剂盒采用了非特异性结合比 avidin 更低的 strepatavidin，使检测结果背景更低灵敏度更高。
EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X)中含有 poly(dI-dC)等有效成分。
其中 poly(dI-dC)的浓度经过优化， 可以很好的消除蛋白和标记探针间的非特异性结合，同时又不会减弱目的转录因子和标记探针间的结合。
本试剂盒可以用于 20 个蛋白和探针的结合反应， 并足够检测至少 2 块有生物素标记 EMSA 探针的膜。
二、组份列表 产品组份 EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) EMSA/Gel-Shift 上样缓冲液(无色，10X) EMSA/Gel-Shift 上样缓冲液(蓝色，10X) ECL Reagent A ECL Reagent B Streptavidin-HRP Conjugate 封闭液 洗涤液(5X) 检测平衡液 规格（ 规格（50T） 100µl 100µl 100µl 28ml 28ml 50µl 190ml 125ml 125ml 保存温度 -20℃ -20℃ -20℃ 4℃ 4℃ -20℃ 4℃ 4℃ 4℃注：如果长期不用，整个试剂盒可-20℃保存，-20℃可以保存更长时间。
EMSA试剂盒使用方法介绍
可用于定性和定量分析。
这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
通过EMSA可以研究目的蛋白和特定的DNA序列的结合情况，从而可以研究细胞内一些转录因子的激活水平。
其原理如下：本产品具有下列特点：1.一站式，使用方便，本试剂盒提供了进行EMSA实验的探针标记、蛋白和DNA结合以及EMSA上样液等主要试剂，使EMSA实验变得简单方便。
2.非特异性结合低，EMSA结合缓冲液中含有poly(dI-dC)等有效成分，其中poly(dI-dC)的浓度经过优化，可以很好的消除蛋白和标记探针间的非特异性结合，同时又不会减弱目的转录因子和标记探针间的结合。
3.用户需自备待标记的EMSA探针、用于探针标记的同位素、EMSA胶配制的相关试剂。
4.本试剂盒足够标记10-20次探针，足够进行100个蛋白和探针的结合反应。
规格及成分成份编号100次包装T4 Polynucleotide Kinase 131039A 100 UT4 Polynucleotide Kinase131039B 100 μLBuffer(10×)Nuclease-Free Water 131039C 1 mL探针标记终止液131039D 100 μL5M 醋酸铵131039E 600 μLEMSA结合缓冲液(5×) 131039F 200 μLEMSA上样液(蓝色，10×) 131039G 200 μLEMSA上样液(无色，10×) 131039H 200 μLTE溶液131039I 2 mL上样缓冲液。
如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至能观察到蓝颜色即可。
五、电泳分析1.用0.5×TBE作为电泳液。
按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。
预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1×的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。
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细胞核蛋白或纯化的转录因子 2µl
未标记的探针
1µl
标记好的探针
1µl
总体积
10µl
突变探针的冷竞争反应：
Nuclease-Free Water
4µl
EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2µl
细胞核蛋白或纯化的转录因子 2µl
未标记的突变探针
1µl
标记好的探针
1µl
总体积
10µl
Super-shift反应：
装置，电转时可以设置为380mA(约100V)转膜30-60分钟。如果胶较厚，则需适当延长转膜时间。转膜时需保持转膜 液的温度较低，通常可以把电转槽置于4℃冷库或置于冰浴或冰水浴中进行电转，这样可以确保低温。具体的电转膜 方法请参考电转膜装置的使用说明。 G. 转膜完毕后，小心取出尼龙膜，样品面向上，放置在一干燥的滤纸上，轻轻吸掉下表面明显的液体。立即进入下一 步的交联步骤，不可使膜干掉。 7. 交联： A. 用紫外交联仪(UV-light cross-linker)选择254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联45-60秒。如果没有紫外交联仪可以使用普 通的手提式紫外灯(例如碧云天的手提紫外检测仪(EUV002))，距离膜5-10厘米左右照射3-10分钟。也可以使用超净工 作台内的紫外灯，距离膜5-10厘米左右照射3-15分钟。最佳的交联时间可以使用标准品自行摸索。 B. 交联完毕后，可以直接进入下一步检测；也可以用保鲜膜包裹后在室温干燥处存放3-5天，然后再进入下一步检测。 如果检测结果发现交联效果不佳，甚至连free probe的条带都非常微弱，可以考虑在膜干燥后参考步骤A的条件再交联 一次，以进一步改善交联效果。 8. 化学发光法检测生物素标记的探针： A. 37-50℃水浴溶解封闭液和洗涤液。 注意：封闭液和洗涤液必须完全溶解后方可使用，封闭液和洗涤液可以在室温至50℃之间使用，但必须确保这两种 溶液中均无沉淀产生，在冬天需特别注意。 B. 取一合适的容器加入15ml封闭液，再放入交联过的含有样品的尼龙膜。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。 C. 取7.5µl Streptavidin-HRP Conjugate加入到15ml封闭液中(1:2000稀释)，混匀备用。 D. 去除用于尼龙膜封闭的封闭液，加入上一步中配制的15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封闭液。在侧摆摇床或水 平摇床上缓慢摇动15分钟。 E. 取25ml洗涤液(5X)，加入100ml重蒸水或MilliQ级纯水，混匀配制成125ml洗涤液。 F. 将尼龙膜转移至另一装有15-20ml洗涤液的容器内，漂洗1分钟。 G. 去除洗涤液，加入15-20ml洗涤液，在侧摆摇床或水平摇床缓慢上洗涤5分钟。 H. 重复步骤G 三次(共洗涤四次)，每次洗涤时间都约为5分钟。 I. 将尼龙膜转移至另一装有20-25ml检测平衡液的容器内，在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动5分钟。 J. 取5ml BeyoECL Plus Reagent A和5ml BeyoECL Plus Reagent B混匀，配制成BeyoECL Plus Reagent工作液。注意： BeyoECL Plus Reagent工作液必须现配现用。说明：从本步骤起操作方法和注意事项同Western实验的荧光检测。 K. 取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。立即将膜的样品面向上，放置到处于水平桌面上的洁净容器内或保鲜膜上。 L. 在尼龙膜的表面小心加上步骤J配制好的共10ml BeyoECL Plus Reagent工作液，使工作液完全覆盖尼龙膜。室温放置 2-3分钟。 M. 取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。将尼龙膜放在两片保鲜膜或其它适当的透光薄膜中间，并固定于压片暗盒(也 称片夹)内。 N. 用X光片压片1-5分钟。可以先压片1分钟，立即显影定影，然后根据结果再调整压片时间；也可以直接分别压片30 秒、1、3、5分钟或更长时间，然后一起显影定影观察结果。
标记好的探针
1µl
总体积
10µl
Nuclease-Free Water
5µl
EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2µl
细胞核蛋白或纯化的转录因子 2µl
标记好的探针
Байду номын сангаас
1µl
总体积
10µl
探针冷竞争反应：
Nuclease-Free Water
4µl
EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2µl
免产生气泡，并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。
4. EMSA结合反应：
A. 如下设置EMSA结合反应：
阴性对照反应：
样品反应：
Nuclease-Free Water
7µl
EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2µl
细胞核蛋白或纯化的转录因子 0µl
5. 电泳： A. 用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释 好的1X的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。 B. 把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10µl稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲 液(蓝色)，用于观察电泳进行的情况。 C. 按照10V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上 样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。
BeyoECL Plus Reagent A BeyoECL Plus Reagent B Streptavidin-HRP Conjugate
封闭液 洗涤液(5X) 检测平衡液
说明书
包装 200µl 200µl 200µl 55ml 55ml 100µl 380ml 250ml 250ml 1份
保存条件：
¾ 本试剂盒采用了高质量的Streptavidin-HRP Conjugate，HRP和Streptavidin共价交联的比例大于3，这样比采用Streptavidin和 Biotin-HRP conjugate两种试剂进行检测要更方便，并且灵敏度更高。
¾ 本试剂盒采用了非特异性结合比avidin更低的strepatavidin，使检测结果背景更低灵敏度更高。 ¾ 本试剂盒和碧云天的各种生物素标记EMSA探针可以配套使用。 ¾ 本试剂盒没有提供生物素探针标记相关的试剂，其它特定的生物素标记EMSA探针的制备可以使用碧云天的EMSA探针生
包装清单：
产品编号 GS009-1 GS009-2 GS009-3 GS009-4 GS009-5 GS009-6 GS009-7 GS009-8 GS009-9
—
产品名称 EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X) EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色，10X)
3. EMSA胶的配制： A. 准备好倒胶的模具。可以使用常规的制备蛋白电泳胶的模具(例如BioRad的常规用于蛋白电泳的制胶装置)，或其它适
当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大
EMSA胶的模具。制胶前必须把制胶模具冲洗干净，需特别注意不能有SDS残留。 B. 按照如下配方配制20ml 4％的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。
C. 加入1µl EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结 合，建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以 在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至可以观察到蓝颜色即可。
GS009-1至GS009-3和GS009-6在-20℃保存，其余可4℃保存。如果长期不用，整个试剂盒可-20℃保存，-20℃可以保存更 长时间。
注意事项： ¾ 需自备带正电荷尼龙膜，以及凝胶电泳时所需的相关试剂。带正电荷尼龙膜(FFN12/FFN16)可以向碧云天订购。
¾ 如果需要使用更多的封闭液或洗涤液，可另外单独订购GS009B封闭液或GS009W洗涤液(5X)。 ¾ 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用本产品的文献：
1. Wang X, Li C, Chen Y, Hao Y, Zhou W, Chen C, Yu Z.
Hypoxia enhances CXCR4 expression favoring microglia migration via HIF-1alpha activation.
TBE buffer (10X) 重蒸水
1.0ml 16.2ml
39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v) 80% 甘油 10% 过硫酸铵(ammonium persulfate)
2ml 625µl 150µl
TEMED
10µl
C. 按照上述顺序依次加入各种试剂，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避
6. 转膜： A. 取一和EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜，剪角做好标记，用0.5XTBE浸泡至少10分钟。尼龙膜自始至终仅能使用镊 子夹取，并且仅可夹取不可能接触样品的边角处。 B. 取两片和尼龙膜大小相近或略大的滤纸，用0.5XTBE浸湿。 C. 把浸泡过的尼龙膜放置在一片浸湿的滤纸上，注意避免尼龙膜和滤纸间产生气泡。 D. 非常小心地取出EMSA胶放置到尼龙膜上，注意确保胶和膜之间没有气泡。 E. 再把另外一片浸湿的滤纸放置到EMSA胶上，注意确保滤纸和胶之间没有气泡。 F. 采用Western时所使用的湿法电转膜装置或其它类似的电转膜装置，以0.5XTBE为转膜液，把EMSA胶上的探针、蛋白 以及探针和蛋白的复合物等转移到尼龙膜上。对于大小约为10x8x0.1cm的EMSA胶，用BioRad的常用的Western转膜