家畜性别控制简介

LAMP法
• LAMP法是Hirayama 于2004年发明的1种 环式恒温基因扩增技术 (Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP),并且 Loopamp公司随后推出了其相应的胚胎性 别鉴定试剂盒和浊度仪。
LAMP法
• 该方法使用了4种不同的引物, 对牛胚胎细 胞中的雄性特异性核酸系列和雌雄共有核 酸系列进行扩增反应,通过检测有无扩增反 应来鉴定牛胚胎细胞的性别。有无扩增反 应是通过检测反应过程中获得的副产品焦 磷酸镁所形成的白色沉淀的混浊度来判定。
免疫学方法
• 免疫学方法是利用H-Y 抗血清或H-Y 单克 隆抗体检测胚胎上是否存在雄性特异性H-Y 抗原,从而鉴定出胚胎性别的一种方法。 • 对胚胎的 H-Y 抗原检测有 3 种方法:细胞毒 性分析法、囊胚形成抑制法、间接免疫荧 光法 。
细胞毒性分析法
• 将 H-Y抗血清与补体 (鼠血清 )加入培养液 中对胚胎进行培养 ,表达 H-Y抗原的雄性胚 胎有一定程度的细胞裂解或发育受阻 ,不能 形成正常的囊胚 ,此类胚胎判为雄性 ,相反 则被判为雌性。 • 此方法缺点是以毁掉雄胚为代价 ,且准确率 不高 ,并降低了胚胎的成活率。因而现在已 经很少采用。
间接免疫荧光法
• 将胚胎在含有 H-Y抗血清或单克隆抗体的 培养液中培养 ,然后再加入异硫氰酸盐荧光 素标记的第二抗体 ,在荧光显微镜下观察是 否呈现特异荧光 ,有荧光者为雄胚 ,无荧光 者为雌胚。 • 此方法的特点是不损害胚胎 ,但对荧光强弱 的估价主观性较强 , H-Y抗体特异性不高 , 准确率较低。
多重PCR鉴别牛早期胚胎性别
PCR扩增法现存问题
• PCR 法鉴定胚胎性别的技术现在还处于实 验室研究阶段，如果要将其用于生产实际, 还有许多亟待解决的问题： • ①改进取样技术, 降低对胚胎的损伤,在保证 性别鉴定准确率的同时,争取提高移植妊娠 率； • ②简化及规范操作程序,降低外源DNA 污染 的可能性,避免假阳性、假阴性结果。
流式细胞仪精子分离法
精子的流式细胞分离的现存问题
• 按照目前常规情况 ,每小时只能分离得到 11 ×106个左右的 X精子或 Y精子 ,这就造成了 分离精子的价格和商业化成本偏高。 • 目前 ,分离精子人工授精的受胎率只有常规 冷冻精液的 70 %～80 % 。
胚胎的性别鉴定
• 细胞遗传学方法 • 免疫学方法 • 分子生物学方法
精子的流式细胞分离的发展
• 20 世纪 60 年代流式细胞仪诞生 。 • 1989 年, Johnson 等用流式细胞仪成功地分离兔 的 X和Y精子,并通过人工授精得到兔子后代 。 • 1993 年 ,Gran等使用流式细胞仪分离牛的精子， 并通过人工授精得到犊牛。 • 现今流式细胞仪被应用到猪、牛、 羊以及人的研 究上, 均获得较大成功, 精子分离纯度可达 85% ~ 90%。
环境因素对性别控制的影响
• Y精子头小而圆,体积也小,在相同动力下比 X精子运动快,但不耐受疲劳和酸环境,而 X 精子则刚好相反。
环境因素对性别控制的影响
• 营养条件、激素水平、输精时间、卵子成 熟状态、微量元素水平、生殖道的pH、生 殖道中的精氨酸含量、冷冻精液的解冻温 度、胚胎发育过程中子宫内葡萄糖浓度等， 都会在一定程度上影响后代的雌雄比例。
PCR扩增法
• PCR 扩增法的实质是对性别决定有关基因 ( 如SRY 基因) 的检测。该方法是对早期胚 胎进行活组织取样, 合成特异性引物,然后应 用PCR 技术对性别决定有关的基因进行检 测,能扩增出目标条带的胚胎为雄性胚胎,否 则为雌性胚胎。
PCR扩增法
• 澳大利亚首先采用 PCR技术扩增牛 Y染色 体特异 DNA片段鉴别奶牛胚胎性别,准确率 达 90%以上。
分子生物学方法
• • • • DNA探针法 PCR扩增法 荧光原位杂交法 ( FISH) LAMP法
DNA探针法
• 以从 Y染色体上分离出的特异性片断作为探 针 ,将其标记后对检测的胚胎进行 Southern 杂交 ,阳性结果为雄性 ,阴性结果为雌性。 • 由于每种动物都必须有其特异性探针 ,过程 较繁杂、 耗费时间较长 ,在应用上受到一定 限制。
囊胚形成抑制法
• 将 H-Y抗血清与桑椹胚共同培养一段时间 , 雄性胚胎则被 H-Y抗体所抑制 ,不能形成囊 胚腔 ,而无 H-Y抗原的雌性胚胎则不被 H-Y 抗体所抑制 ,可发育形成囊胚 ,从而将雌、 雄胚分开。
囊胚形成抑制法
• 优点：经此方法鉴定的胚胎移植后与正常 胚胎没有差别 ,因而比较实用。 • 缺点：容易将一部分发育迟缓的雌胚误判 为雄胚。
性别控制的方法
流式细胞分离
胚胎性别鉴定
环境因素
细胞遗传学方法
分子生物学方法
免疫学方法
DNA探针
PCR扩增法
（FISH）
LAMP法
家畜性别控制的发展前景
• 家畜性别控制的研究是家畜繁育的一项重 要课题, 通过 X、Y 精子的分离和胚胎性别 鉴定可以有效地进行家畜性别的控制。家 畜性别控制技术将成为家畜繁育的一项常 规技术, 对各项育种技术的发展和应用都具 有重要的促进作用,对优良家畜的繁殖和增 加畜产品的产量,均具有巨大的经济意义。
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家畜性别控制简介
姓名：王莉娟 学号：112011328002062
家畜性别控制
在畜牧生产中，由于很多生产性状受性别 的控制，如母牛的产奶性状、母鸡的产蛋 性状和公鹿的产茸性状等，所以人们希望 能够人为的控制出生动物的性别, 得到更高 的经济效益。
家畜性别控制的方法
• 精子的流式细胞分离 • 胚胎的性别鉴定 • 环境因素
荧光原位杂交法 ( FISH)
• 荧光原位杂交法 ( FISH) 采用荧光标记的性 染色体 DNA特异探针与胚胎细胞进行原位 杂交以确定胚胎的性别。操作步骤包括荧 光素探针制备、探针和靶DNA的变性与杂 交、观察鉴定三部分。
荧光原位杂交法 ( FISH)
• 杂交既能在分裂间期进行 ,也能在分裂中期 进行 ,应用性广泛 ,同时具有高效快速和错 误率低的优点。缺点是使用放射性物质对 胚胎具有一定毒性。
精子的流式细胞分离
• 一般来说, X 精子比Y 精子含有较多的DNA, 所以用荧光染料Hoechst33342 染色时, X 精子吸收的染料多,发出的荧光也强,因此可 以分辨出X 与Y 精子,再利用计算机控制使 荧光强的X 精子带上正电荷, Y 精子带上负 电荷,然后使其通过高压电场, X、 Y 精子发 生不同方向的偏转,从而达到分离目的。
LAMP法的优点
• (1) 迅速：从冲出胚胎到鉴定结束仅需2～ 3 h, 大大缩短了胚胎在体外的培养时间； • ( 2)精确：它采用雄性特异性以及雌雄共通 引物, 特异性高，但试剂盒对DNA污染反应 极为灵敏, 一旦有极少量的外源DNA污染, 就可能出现假阳性结果； • ( 3) 简便：只需1台Loopamp终点浊度仪, 就能完成扩增、检出、判定整个过程, 无需电泳。
PCR扩增法
• 目前, 从准确性、灵敏性和鉴定时间等因素 考虑, 利用PCR 法进行胚胎性别鉴定, 是最 为理想的胚胎性别鉴定方法。 • 随着PCR 技术的不断改进和简化,相信在不 久的将来这项技术将会在畜牧业生产中得 到应用和推广。
PCR扩增法
• • • • • 简单PCR法 双重或多重PCR法 巢式PCR法 双重巢式PCR法 两温度梯度多重PCR法
细胞遗传学方法
• 细胞遗传学方法，即核型分析法，其基本 原理是在胚胎滋养层上取一部分细胞 ,先用 秋水仙素处理 ,再固定染色 ,检查性染色体 , 根据染色体中期的谱带Hale Waihona Puke Baidu异、Y染色体的大 小及形态判断性别 。
细胞遗传学方法
• 该方法准确率高 ,却阻断了有丝分裂 ,要求 操作人员经验丰富 ,且采集细胞对胚胎有伤 害 ,不适合在生产实践中应用。 • 目前, 该方法主要用来验证其他性别鉴定方 法的准确率。采取此方法鉴定胚胎性别准 确率可达 100%。