小鼠成纤维细胞原代培养
新生鼠肺成纤维细胞原代培养方法的比较与体外肌成纤维细胞分化模型的建立
Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ，Ｔ ａ ｎ ｇ ｓ ｈ ａ ｎ ０ ６ ３ ０ ０ ０ ， Ｈ ｅ ｂ ｅ ｉ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
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［ 关键词 】 成纤维 细胞 ； 原代培养 ； 肌成纤 维细胞 ［ 中图分类号 】 Ｒ ８ １ ３ ． １ １ 【 文献标 志码 】 Ａ
【 文章 编号】 １ ０ ０ ８ — ８ １ ９ ９ （ ２ ０ １ ４ ） ０ ２ － ０ １ ２ ９ － ０ ４
Ｔ ｒ ｙ ｐ ｓ ｉ ｎ ｄ ｉ ｇ ｅ ｓ ｔ ｉ ｏ ｎ ｖ ｅ ｒ ｓ ｕ ｓ ｔ ｉ ｓ ｓ ｕ ｅ ａ ｄ ｈ ｅ ｒ ｅ ｎ ｃ ｅ ｉ ｎ ｐ ｒ ｉ ｍａ ｒ ｙ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｏ ｆ ｌ ｕ ｎ ｇ ｉ ｆ ｂ ｒ ｏ ｂ ｌ ａ ｓ ｔ ｓ ｆ ｒ ｏ ｍ ｎ ｅ ｗ ｂ ｏ ｒ ｎ ｒ ａ ｔ ｓ ａ ｎ ｄ ｅ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ ａ ｍｙ ｏ ｉ ｆ ｂ ｒ ｏ ｂ ｌ ａ ｓ ｔ ｄ ｉ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｔ ｉ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｍｏ ｄ ｅ ｌ ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ
小鼠胚胎成纤维细胞原代培养实验具体步骤及方法
小鼠胚胎成纤维细胞原代培养实验具体方法及步骤将小鼠的胚胎成纤维细胞（MEF）从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置MEF生长培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
一、实验材料准备1. 动物孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。
2. 试剂无Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS)、0.05%胰酶、0.53 mmol/L EDTA溶液、MEF生长培养基(高糖DMEM加10%FBS)。
3. 器械眼科直剪3把、眼科直镊3把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套、200目尼龙滤网、50 ml 和15 ml离心管和手术刀片。
以上物品均需要高压灭菌消毒处理。
二、具体操作1. 处死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开，用另外一组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出子宫，最后用第三组剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。
2. 用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30 ml D-PBS的50 ml离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉D-PBS，再重复此步骤一次，注意要留少许D-PBS，然后将胚胎转移到另一装有D-PBS的平皿中，并用手术刀片将其细细切碎。
3. 用200 ul的移液枪反复、快速地吹打平皿中的液体，转移至15 ml离心管中，于4℃1500 rpm离心5分钟，倒掉上清，以10 ml胰酶重悬沉淀，放在37℃水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。
4. 将上层细胞悬液倒入一个装有10 ml MEF生长培养基的50 ml离心管中，用200目的尼龙网过滤后，以1 500 rpm离心5分钟收集细胞，再用30 ml MEF生长培养基洗涤两次。
5. 细胞沉淀用15 ml MEF生长培养基重悬后进行细胞计数(一般8只14天的胎鼠可获得2-3x107细胞)。
6. 3x106细胞悬浮于15 ml MEF生长培养基中，接种到200 ml培养瓶中。
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养物品准备：6-8周成年小鼠、眼科剪、眼科镊、75%酒精、PBS缓冲液、细胞培养皿、细胞培养瓶、15ml细胞离心管、恒温水平摇床、低速水平离心机、倒置显微镜、DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清、胶原酶II、胰蛋白酶等。
操作步骤：（1）取出2只成年小鼠心脏，并将它们置于含有冰冷的PBS的培养皿中。
（2）将心脏置于无菌细胞培养皿中，并在无菌条件下进行操作。
使用剪刀将心脏切成10块，使用解剖刀将它们缩小至1mm的尺寸。
（3）将组织小块移到盛有PBS的无菌细胞培养皿中，清洗后弃去PBS。
（4）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织5分钟。
注意：摇床速度应调整至80r，以使所有组织片流动并且不会坐在底部，但不应太强以至不能破坏细胞。
消化酶（胶原酶II: 1mg/ml，胰酶: 0.75mg/ml）（5）将混合物放置1分钟，使组织沉淀并丢弃含有碎片和血细胞的上清液。
（6）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织30分钟。
（7）将混合物放置１分钟使组织沉淀到底部，并用移液管收集上清液。
不要收集倾向于漂浮的组织碎片。
（8）将上清放入含有2ml成纤维细胞培养基的15ml细胞离心管中。
（9）800r，离心5min。
（10）将细胞重悬于3-4ml培养基中。
（11）重复步骤6-10，直到所有组织溶解（通常7-10次）。
（12）将细胞悬液平铺到细胞培养皿瓶中，并在37℃下在具有5%二氧化碳的细胞培养箱中培养２小时。
（13）２ｈ后显微镜下观察细胞汇合。
此时成纤维细胞类似于小圆点。
（14）收集并丢弃上清液。
用2.5ml温热的PBS洗涤３次，并用10ml 新鲜的成纤维细胞培养基补充。
在37℃和5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。
糖尿病心肌病小鼠心肌成纤维细胞miR-375表达及其对胶原蛋白Ⅰ合成的影响
糖尿病心肌病小鼠心肌成纤维细胞miR-375表达及其对胶原蛋白Ⅰ合成的影响黄燕;张赢予;王好;周艳芳;张国辉;芮涛【摘要】目的:探讨miR-375在糖尿病心肌病心肌纤维化发生发展过程中的作用机制.方法:原代培养小鼠(C57BL/6)心肌成纤维细胞,采用免疫组织化学染色法鉴定细胞纯度.将培养的第2～3代心肌成纤维细胞随机分成对照组和高糖组,高糖组在处理6,12,24 h后,采用实时定量PCR方法检测各组细胞中miR-375的差异性表达.miR-375抑制剂瞬时转染心肌成纤维细胞,实时定量PCR检测转染效率.免疫组织化学染色检测心肌成纤维细胞中Ⅰ型胶原蛋白的表达.结果:原代分离培养的第2代心肌成纤维细胞纯度可达90％；心肌成纤维细胞经高糖处理6,12,24 h后其miR-375的表达有增加趋势；抑制miR-375的表达后,高糖处理的心肌成纤维细胞内Ⅰ型胶原蛋白的表达显著降低.结论:miR-375可能在糖尿病心肌病心肌纤维化中发挥重要的作用.%Objective:To investigate the effect of miR-375 on cardiac fibrosis in diabetic cardiomyopathy mice.Methods:Cardiac fibroblasts isolated from hearts of C57BL/6 mice were cultured in DMEM medium (low glucose concentration).The purity of cardiac fibroblasts were evaluated by immunohistochemical staining.The second and third generation cardiac fibroblasts were randomly divided into control group (5 mmol/L glucose)and high glucose group (25 mmol/L glucose).The cardiac fibroblasts of high glucose groups were treated by high glucose for different times (6,12,24 h).The different expression of miR-375 in cardiac fibroblasts was detected by real-time quantitative PCR.miR-375 inhibitor was transiently transfected into cardiac fibroblasts by lipofectamineTM2000 reagent; transfection efficiency was detected through real-time quantitative PCR.The expression of collagen Ⅰ in cardiac fibroblasts was evaluated by immunohistochemical staining.Results:The purity of the second generation of cardiac fibroblasts was above 90％.During the time point 6 to 24 h cardiac fibroblasts treated by high glucose,the expression of miR-375 showed an increase tendency;in high glucose and miR-375 inhibitor treated group,the expression of collagen Ⅰ decreased significantly.Conclusion:MiR-375 might play an important role in diabetic myocardial fibrosis.【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》【年(卷),期】2013(023)003【总页数】5页(P197-200,206)【关键词】MiR-375;糖尿病心肌病;心肌纤维化【作者】黄燕;张赢予;王好;周艳芳;张国辉;芮涛【作者单位】江苏大学附属人民医院心内科,江苏镇江212002;江苏大学附属人民医院心内科,江苏镇江212002;江苏大学附属人民医院心内科,江苏镇江212002;江苏大学附属人民医院心内科,江苏镇江212002;江苏大学附属人民医院心内科,江苏镇江212002;江苏大学附属人民医院心内科,江苏镇江212002【正文语种】中文【中图分类】R542.23糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病的常见并发症，其临床诊断是基于糖尿病患者独立于冠心病、高血压和乙醇性心肌病等出现心功能不全［1］。
不同糖浓度对体外培养小鼠成纤维细胞增殖、分化的影响
不同糖浓度对体外培养小鼠成纤维细胞增殖、分化的影响作者：李盛，石汉平，孙冠青，孟锐【摘要】【关键词】创伤愈合成纤维细胞血糖应激反应Abstract： Objective To find the relationship between glucose concentration and the proliferation of fibroblast.Methods The proliferation of mouse fibroblast was tested in different concentration of glucose at 12h,24h,48h with CCK kit.The amount of the out cell type I collagen fibers was tested by the mouse type I collagen Elisa kit,and the expression of αsmooth muscle actin (αSMA) tested by immunochemistry.Results We found that under the medium of low concentration,the proliferation was much more than that in the high concentration groups after 12h,24h and 48h(P<0.01),namely the concentration was negatively correlated with the proliferation.We tested the out cell type I collagen fibers using the mouse type I collagen Elisa kit,but there was no difference between each group(P>0.05).About the expression of mouse αSMA,positive correlation was foundbetween the glucose concentration and the expression of the mouse αSMA.Conclusion At the original augmentation of the blood glucose,the proliferation of fibroblast is not different.But when it gets over a level,the proliferation will be depressed,which can lead to the delay of the healing of raw surface；the concentration of glucose has nothing to do with the out cell type I collagen fibers；the concentration of glucose is a factor which enhances the variation from fibroblast to myofibroblast,and the concentration of glucose is positively correlated with the tendency of the variation.Key words：wound healing;fibroblast;blood glucose;stress reaction在外科危重患者中常常遇到高血糖，其中主要是存在许多糖尿病患者，糖尿病损伤修复时，损伤组织的高糖环境对成纤维细胞的生长有着很大影响，使得创面愈合这一过程变得更为复杂。
人类小鼠原代肺成纤维细胞分离方法
⼈类⼩⿏原代肺成纤维细胞分离⽅法Primary human/mouse lung fibroblast isolation⼈类/⼩⿏原代肺成纤维细胞分离⽅法参考⽂献(H: 1.Katharina Heinzelmann et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2018; 2. Claudia A Staab-Weijnitz et al. Am J Respir Crit Care Med. 2015. FK506-Binding Protein 10, a Potential Novel Drug Target for Idiopathic Pulmonary Fibrosis; M: Isolation and characterization of mouse fibroblasts, Benjamin L. Edelman and Elizabeth F. Redente)Materials:材料：1. Digestion solution: a).Liberase TM (5401119001, Merck) solution,2.5mg/ml (HBSS);b).DNAse (D4263-5VL, Sigma), 2000U/ml(PBS)消化液：a) Liberase TM 溶液（5401119001, Merck）：溶于HBSS（终浓度2.5mg/ml）b) DNAse溶液（D4263-5VL, Sigma）：溶于PBS（终浓度2000U/ml）2. Nylon filters 40/70 µm3. Complete medium (Mouse: DMEM/F12 + 20% FBS + 1% Penicillin/Streptomycin + 0.1% Amphotericin B + 1% Glu; Human: DMEM/F12 + 20% FBS + 1%Penicillin/Streptomycin + 0.1% Amphotericin B)4. Knife (disposable)5. Syringe6. PBSDigestion solution:Steps: (Mouse from 1-13, Human from 7-13)步骤：1. Weight the mouse, calculate the amount of anesthesia, Xylazin : Kelamin : NaCl =1:4:5, 100ul/10g weight;称重⼩⿏后⿇醉2. Inject and wait 10min till the mouse sleep腹腔注射后等待10分钟3. Open abdomen and cut the artery of the kidney打开腹腔切断肾动脉4. Use syringe insert the heart and rinse with 15ml PBS until it’s white注射器灌注15ml PBS后插⼊⼼脏冲洗⾄肺部变⽩5. Take out the lung and heart in the tube with ice将⼼脏和肺取出置于冰盒中保存6. Wash with 80% ethanol in 10s在80%酒精中漂洗10秒7. Wash with PBS 3 times, 10min (Mouse); PBS 3 times, 30min (Human)PBS洗3次，每次10分钟（⽼⿏），每次30分钟（⼈），清洗时保存于冰盒中8. Dissected into pieces of 1cm2 in size and digested by digestion solution at 37°C for 1hours (shake vigorously every 15min)使⽤⼀次性⽆菌⼑⽚将组织切成⼩块，并加⼊消化液在37度⽔浴锅中静置1⼩时（每15分钟猛烈上下摇晃试管）9. Samples were filtered through nylon filters with a pore size of 70 µm使⽤70微⽶过滤器过滤标本10. Centrifuged at 400 g, 4°C for 5 minutes, resuspended in complete medium400 g, 4°C, 离⼼5分钟，离⼼后加⼊完全培养基重悬11. Samples were filtered through nylon filters with a pore size of 40 µm使⽤40微⽶过滤器过滤标本12. Centrifuged at 400 g, 4°C for 5 minutes, resuspended in complete medium400 g, 4°C, 离⼼5分钟，离⼼后加⼊完全培养基重悬13. Medium was changed after 2 days (first check) and cells were split after reaching aconfluence of 80–90%. For the present study, phLF were used in passages 4-9.2天后检查细胞状态并换液，当密度达到80–90%时可传代，原代成纤维细胞最佳使⽤为4-9代。
小鼠细胞实验培养步骤
小鼠细胞试验培养步骤小鼠细胞常用的分别方法有两种，一种是贴块法，一种是消化法，这两种方法都可以用于分别和培养原代细胞。
一、试验分别和培养步骤1. 小鼠颈椎脱臼处以死刑后，剃除腹胸部的被毛，放入装有75%酒精的烧杯中浸泡5min。
2. 取出小鼠，在无菌环境下打开胸腔，取出心脏组织，注入盛有无菌1×PBS的培养皿中，洗净组织表面的血液。
3. 将清洗干净的心脏组织转入装有75%酒精的培养皿中浸泡15s以杀死大多数的心脏被膜细胞，浸泡完成后赶忙转入装有无菌1×PBS的培养皿中震荡清洗。
4. 清洗完成后，用剪刀镊子搭配除掉自动脉弓和心房组织，仅保管心室部分，再次用1×PBS清洗去除心室内的血液。
5. 将清洗干净的心室组织用剪刀减成1mm3大小左右的碎块，之后用PBS清洗若干次后按下述两种方法之一进行后续操作。
A. 贴块法6. 将清洗好的碎块转入另一培养皿中，用0.25%胰蛋白酶消化液浸泡组织，室温消化3—5 min。
7. 消化完成后，添加数毫升FBS停止消化，之后吸弃液体，加PBS清洗组织块1伺次后，用200 ul吸头将组织块平均接种于T—25培养瓶的培养面上，之后将培养瓶放置于37℃二氧化碳培养箱中，静置2—4h。
8. 待组织处于略微脱水的状态时，小心添加2ml培养基，添加时注意尽量不要将组织块冲起，要使培养基接触全部的组织块。
9. 之后放入培养箱中连续培养，一般2—4天后成纤维细胞会从组织块四周爬出，待爬出的细胞有较多数量时，可将细胞消化下来，去除组织块，转入另一培养瓶中培养。
B. 消化法6. 将清洗好的碎块转入另一离心管中，加入混合消化液（0.08%胰酶+0.06%Ⅱ型胶原酶）37℃水浴消化8 min后，吸取上层混悬液弃去。
7. 余下组织加入混合消化液10 ml，37℃水浴震荡消化10 min；吸取上层悬液至另一离心管中，加入适量FBS停止反应；剩余沉淀物再加消化液消化3—5次，直至组织块消化。
原代培养中成纤维细胞的抑制
尽量除去杂质细胞：现在一般的做法是：将消化完全的细胞悬液先在大的培养瓶中培养1~2小时，然后再小心的吸出仍然悬浮的心肌细胞，再接种到6孔或24孔板上。这样做主要是尽量除去成纤维细胞。由于成纤维细胞贴壁迅速，而心肌通常在4h后才开始贴壁，这样才能尽量利用差速贴壁法除去成纤维细胞。
（2）机械划除法
原代培养成功后，上皮细胞和成纤维细胞所数都同时出现，混杂生长。这种混杂生长常常分区成片，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。因此可以采用机械的方法去除不需要的细胞。
（3）反复贴壁法
成纤维细胞与上皮细胞相比，其贴壁过程快，大部分细胞常能在短时间内大约10－30min完成附着过程，而上皮细胞大部分在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，这样可以利用此差别来纯化细胞。
方法：
1.取材：4～6ｗＷｉｓｔａｒ大鼠,大剂量2%戊巴比妥钠麻醉处死，将处死后的大鼠浸入75%酒精中，放入超净台。在无菌状态下剪开胸腹腔，分离胸主动脉,用2ｍｌ注射器从主动脉弓处向胸主动脉注入D-Hank’s液,驱除残血,取主动脉弓至肾动脉一段，两端结扎剪断，放入60℃预热无菌水中2秒。然后置于准备好的RPMi1640培养基（含双抗）中。
【wangtsy】胰岛的分离与纯化
取新生1-3天SD大鼠10-15只，无菌条件下剖腹取出胰腺置入无菌培养皿中，用眼科剪去除非胰腺组织，4℃Hanks液清洗三次后，用眼科剪反复剪切至<0.5mm3组织块，取浓度为1g/L的V型胶原酶溶液5-10ml与之混合,转入三角烧瓶中，于37℃恒温水浴振荡器消化30-40min，加入两倍体积4℃Hanks液终止消化，用吸管反复吹吸后过80目筛网，滤液以800rpm低速离心70s去上清液，并用4℃Hank's液低速离心清洗2次，除去单个腺泡及上皮细胞。加入含2.5mg/L碘乙酸的PRMI1640完全培养基（含10%胎牛血清、10mmol/L HEPES缓冲液、1mmol/L丙酮酸钠、100000u/L青霉素G钾、100mg/L链霉素、71.5umol/L β-巯基乙醇）中制成细胞悬液,接种于75ml玻璃培养瓶中,于37℃,5%CO2,95%空气条件下培养5h后，用无血清培养基低速离心清洗3次,以除去成纤维细胞。然后用正常完全培养基培养24h，转瓶弃去贴壁细胞，用无血清培养液低速离心洗涤两次，沉淀物即为纯化胰岛。再用PRMI1640完全培养基养吧，可长成胰岛单层细胞。
小鼠乳腺上皮细胞体外原代培养方法研究进展
小鼠乳腺上皮细胞体外原代培养方法研究进展摘要综述了有关于小鼠乳腺上皮细胞体外原代培养方法的研究进展,阐述了乳腺细胞培养的意义,介绍了乳腺组织原代培养的过程,并分析了所取得的研究成果。
关键词小鼠;乳腺上皮细胞;原代培养;细胞工程原代培养即直接从有机体摘取细胞、组织或器官,使其在体外维持与生长。
合适的培养条件对体外培养细胞的生存和增殖都十分重要。
一般而言,不同动物、不同组织器官来源的细胞对培养条件的要求存在一定差异,因此,需要使体外环境下的培养条件尽可能地模拟体内环境。
体内乳腺组织的增殖、分化和组织结构重塑受内环境(如类固醇、生长因子、结合蛋白及细胞外基质间复杂的相互作用等)因素的影响和作用,这些因素同样也影响体外培养乳腺上皮细胞的增殖分化和功能表现。
对于某种动物特定组织细胞的体外培养,对培养液、添加因子、附着底物及培养温度、pH值等都需进行仔细的选择,乳腺上皮细胞的体外培养建立在乳腺上皮原代培养细胞的基础上,针对不同的研究目的应采取不同的培养方法,以对细胞进行分化诱导。
张以涛比较了不同pH值、不同血清浓度配比的生长培养液对小鼠乳腺上皮细胞生长的影响,结果表明, pH值7. 4含10%血清的培养基为最佳生长液。
现代研究普遍认为,内分泌激素在乳腺上皮细胞发育各个阶段都发挥影响作用,不同时期乳腺组织的形态、组成及功能均有差异,这对选择乳腺上皮细胞体外培养的取材时间有指导意义。
张以涛比较了取自不同时期乳腺上皮细胞的生物学特性,得出妊娠期细胞生存、增殖能力均强于泌乳期细胞,妊娠期小鼠乳腺为获得细胞的最佳取材时期。
乳腺上皮细胞的原代培养,首先是尽可能地分离出乳腺上皮细胞,同时减少分离过程对细胞的损伤和浪费,以及通过采用一定的方法,使最终得到富集的乳腺上皮细胞及杂质细胞尽可能少甚至被完全清除。
1乳腺细胞培养的意义将动物细胞或组织在体外进行培养,能有效排除神经体液等因素对其造成的影响,可直接进行药物对细胞的活动代谢、毒性和杀伤作用等检测,如秦君等以王不留行为试验材料,对其3类主要成分(皂甙类、黄酮甙类及香豆素类)进行提取,分别以不同浓度添加到细胞培养液中,寻找王不留行促进泌乳的有效成分。
小鼠成纤维细胞原代培养启示和收获
小鼠成纤维细胞原代培养启示和收获
小鼠成纤维细胞原代培养的启示和收获有：
- 培养细胞刺激增殖的能力强且可靠、易培养、来源丰富，常被用作干细胞培养的饲养层，一方面提供刺激干细胞增殖的各种因子，另一方面保持干细胞的未分化状态。
- 可应用于细胞保种、分子生物学研究和基因治疗相关研究。
小鼠成纤维细胞原代培养可以为生物学研究提供丰富的细胞来源，同时也可以为细胞保种提供支持。
在进行小鼠成纤维细胞原代培养时，需要注意细胞的生长环境和条件，以确保培养的细胞具有良好的生物学特性。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
细胞的原代培养点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园一、原代细胞培养原理原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。
借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。
• 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养• 掌握无菌操作技术• 了解小鼠解剖操作技术• 了解原代细胞培养的一般方法与步骤•了解培养细胞的消化分散• 了解倒置显微镜的使用二、实验材料• 实验动物：孕鼠或新生小鼠• 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清）0.25%胰蛋白酶平衡盐溶液70%乙醇•器材：灭菌镊子、剪刀若干把灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个吸管若干支酒精灯原代细胞培养方法三、胰酶消化法（1）胰酶消化法操作步骤——取材a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。
d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。
e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。
f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。
继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。
（2）胰酶消化法操作步骤——切割a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。
b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。
c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
（3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
原代细胞的培养与鉴定方法
1、大鼠骨髓来源肥大细胞原代培养并鉴定：脱颈法处死SD大鼠（体重约200g），75%酒精浸泡消毒3min。
转入超净工作台内操作，剪开后肢皮肤，去除腿部肌肉，暴露出股骨，尽可能将股骨外部肌肉剥离干净，剪下股骨。
剪去股骨两端的股骨头，使用5ml注射器吸取RPMI 1640基础培养基后将骨髓吹打出来，吹打过程中尽可能将骨髓冲洗干净。
使用巴氏吸管将骨髓吹打成单细胞悬液，1000rmp/min离心5min收集细胞如发现收集的细胞中有大量红细胞时需使用红细胞裂解液处理。
使用肥大细胞专用培养基重悬细胞，接种至T25瓶内培养。
培养过程中每2-3天换液一次，当发现有细胞变圆脱落时，收集脱落细胞至新的T25瓶内诱导培养，培养四周时肥大细胞诱导成熟，取成熟的肥大细胞进行甲苯胺蓝染色鉴定；取脱落细胞培养一周、二周、三周、四周的细胞培养上清进行组胺含量检测。
2、小鼠骨髓来源肥大细胞原代培养与鉴定：小鼠经脱颈椎处死，75%酒精消毒后，取完整股骨，用1mL注射器吸取无菌PBS从股骨一端刺入，将骨髓细胞洗出，直到骨髓腔变白。
离心收集细胞，加入3mL红细胞裂解液，室温裂解3min之后，用PBS漂洗2次。
采用现配的原代细胞培养工作液（含青、链霉素各1000U/mL，10% FBS，IL-3 10 ng/mL，SCF 10ng/mL的RPMI-1640培养基培养液）将细胞重悬，按照106个/mL接种于六孔板中，每孔加3mL培养液，置于37℃，5% CO2的培养箱中培养，每7d 将悬浮细胞按照106个/mL转移到新的培养板中，继续培养，4-6周细胞分化成熟。
四周后收集悬浮细胞，部分细胞用于流式检测纯度，部分用含10% FBS的RPMI-1640培养基重新接板。
纯度检测：向诱导分化细胞中按1：200加入肥大细胞表面标志物APC-CD117 ，FITC- FcεRIα，4℃孵育60min ，无菌PBS 漂洗3次，流式检测肥大细胞纯度。
（SCF：Stem cell factor，干细胞因子；又称肥大细胞生长因子MGF）3、大鼠腹腔肥大细胞的分离与培养：选用体重220-250g的SD大鼠。
小鼠滑膜成纤维细胞的原代培养
小鼠滑膜成纤维细胞的原代培养赵进军;胡子有;欧阳晴晴;毋静;陈玉姣;杨敏【摘要】Objective The primary culture of synovial fibroblasts is a convenient tool to study the pathology and physiology of synovialtissues .An improved method was constructed in this study by C57BL /6 mice to study the mechanism of rheumatoid ar-thritis(RA) .Methods The synovium around the hip joints were collected .Attention should be paid to eliminate the "egg-yolk" like yellow oval substance in the middle of the synovium .The synovium was transferred into a 1 .5 mL Eppendorf tube containing 0 .5%type Ⅳ collagenase and cut into 1 mm3 blocks or so .The Eppendorf tube was placed in 37 ℃ Constant temperature orbital shaker incubator for 60 min .After digestion ,the tube was placed on the Vortexfor a high-speed oscillation for 1 .5 minutes to guarantee the separation of cells .Results Within about 1 week ,the first passage was performed by the trypsin digestion method .On day 10 , the number of synovial macrophages reached the maximum and then decreased gradually .After the third generation (day 15 to 20) , the synovial macrophages generally disappeared .Vimentin was suitable for the immunofluorescence cytochemical staining for the synovial fibroblasts .The cell purity was indicated as > 95% .The cytometric analysis indicated that purity of Vimentin and CD90 .2-labelled cells was over 95% ;the purity of CD54-labelled cells was 80% approximately .Conclusion It is a simple and effective method for primary culture of synovial fibroblasts in mice .%目的：利用 C57BL ／6小鼠探索出一种改良的小鼠滑膜成纤维细胞（SF）的原代培养方法，以方便类风湿关节炎（RA）关于滑膜炎的研究。
原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法
原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法实验准备：昆明乳鼠25~30只；生物安全柜；巴氏吸管2支；培养皿2个；原代器械盒；15ml 离心管；50ml离心管各一支；胰酶；PBS；1%双抗；封口膜；酒精灯；Dhanks；实验主要分为两大步骤进行：第一天晚上1、培养皿内加入预冷的PBS+1%双抗。
2、取乳鼠酒精喷全身取心脏放到提前准备的培养皿中无需剪碎稍抖动清洗。
3、所有心脏取完，用巴氏吸管将培养皿中的心脏吸到15ml离心管中，稍等沉降，吸去液体。
4、加入Dhanks冲洗心脏，吸出弃去，将心脏上沾有的血尽量冲洗干净。
5、加入3mlDhanks和5ml胰酶。
封口膜封好，放到饭盒里，四度摇床8-12小时。
第二天上午1、配置二型胶原酶（16.8mg二型胶原酶+21mL DMEM,配好后放到水浴锅预热，微孔滤膜过滤，现用现配）2、8-12小时后，向装有心脏的15ml离心管中加入5ml DMEM完全培养基中和胰酶。
之后小心吸去液体，加入7ml提前准备好的二型胶原酶。
放到37度摇床摇10min转速160r，摇10min后将上清吸到新的50ml离心管中。
这个过程重复3次，基本上心脏全部溶解，只有少量组织。
（每次可以少加二型胶原酶4-5ml多消化几次）3、将50ml离心管中3次收得的上清滤网过滤，离心1000r5min，弃上清，沉淀加入DMEM完全培养基，逐层吹起，加入到细胞培养瓶中。
5只鼠铺一个培养瓶。
4、1.5-2小时后差速，将培养瓶中的培养液转移到六孔板里。
心肌细胞10只鼠一个6孔板即可。
注：用心肌细胞的取6孔板中细胞培养48小时；用成纤维细胞的将培养瓶中差速的瓶用1000ul的枪冲洗30次得到的成纤维细胞相对较纯。
小鼠成纤维细胞原代培养
实验—小鼠成纤维细胞得原代培养一、实验目得１.掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中得取材、消化及无菌操作等基本实验技术与操作过程。
2。
熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞得形态与生长状况得方法．3。
了解细胞原代培养与传代培养得原理与方法。
二、实验原理自１７世纪下半叶Robｅrt Hooｋｅ提出“细胞"概念直至2０世纪中叶，细胞培养(Cell culture)才逐渐发展起来.现代生命科学以及相关领域得研究前提就是细胞得维持与增殖，因此,细胞培养不仅就是细胞生物学得密不可分得组成部分,而且已经成为生物化学、生物物理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学与神经科学、甚至临床医学得重要内容。
细胞培养也就是细胞生物学延伸至相关学科得一条主要途径。
如今,细胞培养已经成为生命科学与医学研究最常用得基础技术之一。
细胞培养就是模拟机体内生理条件,将细胞从机体中取出,在人工条件下,使其生存、生长、繁殖与传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题得研究。
细胞培养得直接目得就是维持或扩增细胞数量。
依据取材于动物组织或培养细胞,细胞培养分为原代培养与传代培养．1.原代培养(pｒimary culture)就是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前得培养。
但实际上通常把第一代至第十代以内得培养细胞统称为原代细胞培养.原代培养就是建立细胞系得第一步,其最基本得方法有两种：组织块培养法与消化培养法.组织块培养法就是指直接从机体取下组织与器官,通过组织块直接长出单层细胞,该培养法就是最常用得原代培养方法，其将刚刚离体得、生长活力旺盛得组织剪成小块接种在培养瓶中作为实验材料，一天后细胞可从贴壁得组织块四周游出并生长。
组织块培养法操作过程简便、易行,培养得细胞较易存活，适用于一些来源有限、数量较少得组织得原代培养。
消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后，在不加任何粘附剂得情况下，直接移植在培养瓶壁上,加入培养基立即进行培养得方法。
血管成纤维细胞原代细胞提取培养
血管成纤维细胞分离与培养一、实验动物8-10周龄C57小鼠10只。
大鼠二、试剂及配制高糖DMEM、0.25%胰蛋白酶, 胎牛血清、青霉素-链霉素混合液。
培养液: 10%DMEM培养基：FBS：双抗 100：10：1（45ml：5ml：0.5ml）20%FBS DMEM三、实验仪器超净工作台、CO2培养箱、光学倒置显微镜、离心机四、组织分离与贴壁1、将小鼠于75%乙醇缸中浸泡5ｓ, 转移至超净台。
用大头针将其固定在无菌的泡沫板上, 用75%乙醇消毒胸、腹部皮肤。
2、取2把弯镊子撕开皮肤, 充分撕拉开, 再用乙醇棉签消毒。
用眼科虹膜剪沿剑突处正中线向上剪开胸骨, 沿正中线向下剪开腹膜，将腹部内脏拨至一旁，充分暴露主动脉，从肾动脉分支处直至心脏剪下, 取出心脏及主动脉, 置于盛预冷PBS液的培养皿中。
3、将鼠心脏主动脉全部取出后, 剪去心房心脏、剔除主动脉上脂肪，预冷ＰＢＳ液清洗3次, 去除血污。
4、纵向剖开血管腔，血管内膜面朝上铺于培养皿上，手术剔除内膜和中膜，PBS漂洗余下半透明血管外膜。
5、贴块法：将血管外膜转移至20%FBS DMEM中，剪成约1mm3的小块，吸弃多余的培养基，培养皿底面朝上置于37℃5%CO2培养箱，干涸4-6h，待组织块贴壁后，将培养皿慢慢翻转放平，滴加含有20%FBS DMEM培养基，使培养液完全浸泡组织块，置于37℃，5%CO2培养箱，每2天换培养液1次，待细胞生长达融合状态（7-10天），胰酶消化传代10%DMEM。
6.胰酶消化法：？五、细胞形态学观察和免疫荧光鉴定成纤维细胞：波形蛋白，内皮细胞：CD31,平滑肌细胞1：分离血管内中外膜比较费时，可以先在显微镜下练习，然后肉眼练习，再到超净台内练，动作尽量要熟练轻柔，避免牵拉过度。
2：剪的组织块要小，最好能小于1*1mm。
可以用刀片切。
3：贴壁距离要小，比5mm*5mm小，可以一次把培养液加到5~7ml，等估计贴牢时可以直接翻瓶。
IRM_2小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养和生物学特性
5 % CO 2、 饱和湿度培养箱培养, 第 2 天全量换液 , 待 细胞生长至融合即可传代。 1 . 2 . 2 MEF的传代纯化和冻存 底 80 % ~ 90 % 时消化传代 , 加入 0 . 25 % 的胰蛋白酶 37 ! 消化 2 m in , 成纤维细胞缩成球形, 而上皮细胞 仍维持原状, 从而将成纤 维细胞与上皮 细胞分离。 传代过程中尽量保持细胞处于高密度生长 , 即传代 比例不超过 1 胞培养。 1 . 2 . 3 M EF 生长曲线 测定
3
3 。 MEF 继续培养和冻存同常规细
M EF 以 2 ∀ 10 /孔 的细胞密 度接种于 24 孔细胞培 养板, 置 37! 、 5 % CO2 培养箱中培养, 每隔 3 d 换液 1 次。每天同一时间点取 3孔用台盼蓝染色计数活
苏州大学学报 ( 医学版 ) 2010 ; 30 ( 1)
3
处于 活 跃 的 增 殖 期 ( S 期 ) ( 分 别 为 25 . 8 % 和 21. 2 % ) , 处于 G 2 /M 期的细胞比例 分别为 27 . 1 %
分离 I RM 2 小鼠 M EFs, 并进行原代培养和传代培 养。观察 M EF s 生长 形态 , 测定第 3 代和第 5 代细胞 生长曲
线、 细胞周期和增殖指数。 结果
胞 , 6 代前 M EF s生长良好。第 3 代和第 5 代 M EF s在培养至第 3 天开始进入对数生长期 , 到第 6 天时细胞数达到高 峰。 M EFs 增殖 活跃 , 第 3 代 和第 5 代细 胞增 殖指 数分 别为 53% 和 46% 。 结 论 M EF s , 为进一步利用 M EF s 研究小鼠的辐射抗性机制奠定了基础。 关键词 : 小鼠胚胎成纤维细胞 ; I RM 2 小鼠 ; 原代培养 中图分类号 : R329. 2+ 4 文献标识 码 : A 文章编号 : 1673- 0399( 2010) 01- 0001- 03
小鼠细胞原代培养取材方法
小鼠细胞原代培养取材方法
小鼠细胞原代培养取材的方法如下：
1. 准备工具和试剂：显微镜、组织培养耗材（培养皿、离心管、无菌吸管等）、组织培养基、酶消化液（如胰蛋白酶）、PBS缓冲液、抗生素/抗菌剂。
2. 选择适当的组织：根据需要培养的小鼠细胞类型，选择相应的组织。
常用的组织包括肝脏、肺、脾脏、肌肉等。
3. 术前准备：将工作台面清洗消毒，准备好所需的培养皿和离心管，并在显微镜下准备好所需的组织。
4. 组织分离：将小鼠人工麻醉后，用无菌PBS缓冲液冲洗外部组织，然后取出所需的组织。
将组织切成小块，放入含有适当酶消化液的离心管中，进行酶消化。
消化时间和温度根据具体实验要求来确定。
5. 组织纯化：将酶消化后的混合细胞悬液通过滤网过滤，去除组织碎片和大颗粒。
然后将悬液离心，收集沉淀细胞。
细胞沉淀可以通过悬液离心的速度和时间的调整来控制纯化程度。
6. 细胞计数：用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，以确定需要的细胞数量。
7. 细胞培养：将收集到的细胞沉淀转移到含有适当培养基的培养皿中。
根据细胞类型的不同，培养条件和培养基的配方也会有所区别。
一般来说，细胞培养条件包括适当的培养基、温度、CO2浓度和湿度。
8. 细胞培养维护：定期更换培养基，观察细胞的生长情况，及时处理培养皿中的细菌或真菌污染，并进行细胞的传代培养。
以上是小鼠细胞原代培养取材的基本方法，具体操作中还需要根据实验需求和细胞类型的特点进行相应调整。
动物细胞原代培养
动物细胞原代培养
小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。 勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在 打开之容器正上方操作实验。容器打开后， 以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取 用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放臵桌面。 细胞培养应在超净工作台或有空气滤过装臵 的工作间里进行。 培养液或其它溶液不应该在工作区以外打开 。 装吸管或吸头的容器也不应该在工作区以外 打开。
31
动物细胞原代培养
原代培养程序
取材 漂洗 剪切 消化 制备单细胞悬液 接种
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动物细胞原代培养
日常维护及注意事项
1.所有镜头表面必须保持清洁，落在镜头表面的灰尘，可用吸耳球吹去，也可用 软毛刷轻 轻的掸去掉。 2.当镜头表面沾有油污或指纹时，可用脱脂棉蘸少许无水乙醇和乙醚的混合液（3:7）轻轻 擦拭。 3.不能用有机溶液清擦其它部件表面，特别是塑料零件，可用软布蘸少量中性洗涤剂清擦。
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动物细胞原代培养
实验动物的选择
小鼠，清洁级。(选择大约一半足孕时间的胚 胎，10－13天龄胚胎含有最大数量的未 分化的间质细胞，成纤维细胞可从这些 细胞衍生获得。)
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动物细胞原代培养
实验材料
药品：RPMI1640培养液，小牛血清(FCS)， 0. 25% 胰蛋白酶 ，PBS（-） 器材：培养瓶1支/组，50ml离心筒2支/组，培 养皿1套/组，吸管1支/组，EP管1支/组 （在无菌室共用试剂车取用），剪子1把 /组，镊子1把/组，滤器1支/组。 设备：水浴摇床、离心机、二氧化碳培养箱、 倒置显微镜
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动物细胞原代培养
操作步骤
1、开机。接连电源。打开镜体下端的电控开关。 2、使用 （1）准备：将待观察对象置于载物台上。旋转三孔转换器，选择较小的物镜。 观察，并调节铰链式双目目镜，舒适为宜。
心脏成纤维细胞原代细胞培养
乳鼠心肌成纤维细胞分离与培养一、实验动物1~3日龄C57小鼠乳鼠10只。
二、试剂及配制高糖DMEM( gibco)、Ⅰ型胶原酶（MP）、0.25%胰蛋白酶(solarbo公司), 胎牛血清（gibco 160000-044）、青霉素-链霉素混合液（solarbo）。
培养液: DMEM培养基：FBS：双抗 100：10：1（45ml：5ml：0.5ml）酶消化液:将胰蛋白酶用PBS缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)稀释, 配成0.1%胰蛋白酶消化液;将Ⅰ型胶原酶溶于PBS缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)中, 配成0.1%的胶原酶消化液。
0.1%胰蛋白酶及01% Ⅰ型胶原酶以2∶1混合, 现配现用。
三、实验仪器超净工作台、CO2培养箱、光学倒置显微镜、离心机……四、组织消化和分离细胞1、将乳鼠于75%乙醇缸中浸泡5ｓ, 转移至超净台。
用大头针将其固定在无菌的泡沫板上, 用聚维酮碘消毒胸、腹部皮肤。
2、取2把弯镊子撕开皮肤, 充分撕拉开, 再用乙醇棉签消毒。
用眼科虹膜剪在剑突处正中线稍偏左向上开胸后用剪子压住胸骨右缘, 使心脏自然跳出, 用弯镊子勾住心脏根部, 取出心脏, 置于盛预冷PBS液的培养皿中。
3、将鼠心脏全部取出后, 剪去心房、剔除心脏上结缔组织、脂肪及血管, 预冷ＰＢＳ液清洗3次, 去除血污。
4、将心脏剪成约1mm ×1mm×1mm的组织块, 刮入加有搅拌子的锥形瓶中, 酶消化液冲洗剪刀及培养皿, 转移至锥形瓶中。
5、加入孵育过的酶消化液为心肌组织的5倍, 37 ℃水浴, 打开磁力搅拌器, 60r/min搅拌10min, 吸管轻轻吹打组织块1min分散细胞, 自然沉降2min后遗弃上清液。
6、再次加入消化酶液8～15ml消化8min。
五、培养细胞1、吸取上清液入离心管, 加入预冷培养液2ml, 吹打均匀后, 1 200r/min离心4min, 弃上清, 细胞沉淀加预冷的培养液吹打后成细胞悬液用封口膜封口放于冰中备用。
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实验-小鼠成纤维细胞的原代培养一、实验目的1.掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中的取材、消化及无菌操作等基本实验技术与操作过程。
2.熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态与生长状况的方法。
3.了解细胞原代培养与传代培养的原理与方法。
二、实验原理自17世纪下半叶Robert Hooke提出“细胞”概念直至20世纪中叶,细胞培养(Cell culture)才逐渐发展起来。
现代生命科学以及相关领域的研究前提就是细胞的维持与增殖,因此,细胞培养不仅就是细胞生物学的密不可分的组成部分,而且已经成为生物化学、生物物理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学与神经科学、甚至临床医学的重要内容。
细胞培养也就是细胞生物学延伸至相关学科的一条主要途径。
如今,细胞培养已经成为生命科学与医学研究最常用的基础技术之一。
细胞培养就是模拟机体内生理条件,将细胞从机体中取出,在人工条件下,使其生存、生长、繁殖与传代,进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
细胞培养的直接目的就是维持或扩增细胞数量。
依据取材于动物组织或培养细胞,细胞培养分为原代培养与传代培养。
1.原代培养(primary culture)就是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。
但实际上通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
原代培养就是建立细胞系的第一步,其最基本的方法有两种:组织块培养法与消化培养法。
组织块培养法就是指直接从机体取下组织与器官,通过组织块直接长出单层细胞,该培养法就是最常用的原代培养方法,其将刚刚离体的、生长活力旺盛的组织剪成小块接种在培养瓶中作为实验材料,一天后细胞可从贴壁的组织块四周游出并生长。
组织块培养法操作过程简便、易行,培养的细胞较易存活,适用于一些来源有限、数量较少的组织的原代培养。
消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后,在不加任何粘附剂的情况下,直接移植在培养瓶壁上,加入培养基立即进行培养的方法。
该方法主要使用生物化学手段将较小体积的动物组织中妨碍细胞生长的间质加以分解、消化,使组织中结合紧密的细胞连接松散、相互分离,细胞失去与间质的连接,活细胞从组织中释放出来形成含单细胞或细胞团的悬液,分散的细胞易与外界进行新陈代谢互动,在短时间内即可贴壁生长成片。
胰蛋白酶主要适用于一些间质少、较软的组织如上皮、肝、肾与胚胎等,胶原酶主要适用于纤维组织、一些较硬的癌组织等的消化中。
原代培养最大的优点就是,组织与细胞刚刚离体,细胞保持原有细胞的基本性质,生物性状尚未发生很大变化,一定程度上更接近于生物体内的生活状态,可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。
一般说来,幼稚状态的组织与细胞,如动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。
2.传代培养 (subculture)就是原代培养细胞或细胞株在体外获得稳定大量同种细胞并维持细胞种延续的过程。
当原代培养成功后,培养的细胞通过增殖达到一定数量后,必需对细胞从原培养瓶中加以分离,经稀释后再接种于新的培养瓶中,这一过程即为传代培养,亦称为继代培养或连续培养。
如果原代细胞就是正常细胞,随着培养时间的延长与细胞不断分裂,形成的单层细胞汇合,细胞之间相互接触而发生接触性抑制,生长速度减慢甚至停止;另外,由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭,加之代谢物积累也不利于细胞生长或发生中毒。
此时,就需要将将培养细胞从原培养器中取出,加以分离,以1∶2或1∶3以上比率转移到另外培养器皿(瓶)内扩大培养,此过程称为传代(passage)。
原代培养细胞经首次传代成功后即成为细胞系,由原先存在于原代培养物中的细胞世系组成。
细胞传代后一般经三个阶段:游离期;指数增生期与停止期。
培养细胞的“一代”就是指传代培养的累积次数,其与细胞世代或倍增不同,细胞转移扩大培养的1代中,细胞约能倍增3～6次。
细胞增殖的旺盛程度通常用细胞分裂指数表示,即细胞群的分裂相数／100个细胞。
一般细胞分裂指数介于0、2％～0、5％,肿瘤细胞可达3～5％。
细胞接种2～3d时分裂增殖旺盛,就是活力最好时期,称指数增生期(对数生长期),适宜进行各种试验。
体外培养细胞与生长类型不同,传代培养的方法也不同。
贴附型生长的细胞要先进行消化,制成细胞悬液再传代;而悬浮型生长的细胞可直接传代,或离心后传代。
3.细胞活力测定:在标准化培养与实验条件下,细胞数目及活力测定极其重要。
1983年Mosmann首次应用MTT比色法检测培养细胞活力。
MTT的化学名称为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名为噻唑蓝。
其具有接受氢原子而发生显色反应。
检测原理为,活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使琥珀酸脱氢,脱下的H＋通过受氢体传递,能使外源性染料MTT还原为不溶性的蓝紫色结晶物,并沉积在细胞中。
细胞中的蓝紫色结晶物可以溶解在二甲基亚砜(DMSO)中,并表现为一定的色度。
用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,并根据光吸收值的高低判断活细胞数量。
在一定细胞数范围内,光吸收值与活细胞数成正比。
死细胞内酶失去活性,故无此功能。
该检测方法灵敏度高、重复性好、操作简便、经济安全,具有良好的相关性。
广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
三、实验物品1.材料:乳鼠、、HeLa细胞(人宫颈癌细胞)。
2.器材:超净工作台、解剖器材、酒精灯、离心管、移液管、吸管、烧杯、大平皿、96孔培养板、不锈钢滤网(100目、200目)、水浴箱、血细胞计数板、培养瓶、CO2培养箱、离心机、盖玻片,擦镜纸,香柏油、倒置相差显微镜、显微镜、全自动酶标仪(bio-rad550型)。
3.试剂:(1)75％乙醇(2)PBS液(pH7、2)配方:Nacl 8g、Kcl 0、2g、Na2HPO4 1、44g、KH2PO4 0、24g 调pH 7、4 定容1L(3)无钙、镁离子PBS液(4)D-HanK液(无钙、镁离子的HanK液)(5)消化液(0、25%胰蛋白酶、0、02%EDTA各1份)(6)0、25％胰蛋白酶溶液(胰蛋白酶0、25g、D-Hanks液100ml,pH7、4)(7)0、4%台盼蓝、(8)培养液:EMEM培养液(Eagle’s Minimum Essential Medium Eagle氏最低要求培养基):EMEM85份,小牛血清15份,加入青霉素、链霉素贮存液1份,使青霉素、链霉素的最终浓度分别为100单位及100 ng/ml。
EMEM培养基可选用各种商品供应之粉末培养基,按生产厂商提供资料配制并除茵。
4℃冰箱贮存。
DMEM(Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium):RPMI1640培养液(90%RPMI 1640、10%胎牛血清、双抗(青霉素,链霉素)100单位/ml 7、4%NaHCO3调pH至6、8～7、0)RPMI1640维持液(5%胎牛血清、余同上)(9)0、5%MTT 溶液(5mg/ml)、MTT 0、5g,溶于100 ml的磷酸缓冲液(PBS),用0、22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌,放4℃避光保存两周内有效。
在配制与保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住。
最好现用现配。
(10)二甲基亚砜(11)碘伏四、实验步骤原代培养组织块培养法:1.动物处死取新生大鼠(出生2～3天)一只,用颈椎脱臼法处死;为避免过多血细胞的干扰,也可采用剪断颈动脉放血的方法处死。
然后,把新生大鼠浸入盛有75％乙醇的烧杯中2-3秒,取出后放在大平皿中携入超净工作台。
2.取材用碘酒与75％乙醇再次消毒一次,打开消毒器械包用镊子新生大鼠腹部皮肤,用解剖剪开腹腔,充分暴露腹腔;用另一镊子轻轻夹起肠管,翻置一侧,充分暴露位于腹腔背壁脊柱两侧的肾脏(右肾略低);取下双侧肾脏,放入消毒培养皿中。
(或取出肝组织置于培养皿中。
)3.剪切剪开肾膜,剥向肾门,去除肾膜及脂肪;用吸管吸取灭菌PBS(或Hanks液)将肾脏清洗3次,去除血污;将肾脏移入另一平皿中,沿纵轴剪开肾脏,剪去肾盂,用眼科剪将肾组织反复剪碎,直到剪成0、5～1mm3组织块;用吸管加2～3滴培养液轻轻吹打,使组织块悬浮在培养液中。
(或肝组织用Hanks液反复冲洗,以除去血细胞,将肝组织移入另一个培养皿中,用吸管吸取0、5ml培养基置于肝组织上,用另一眼科剪将其剪成0、5～1mm3组织块。
)4.接种:用弯头吸管小心分次吸取组织块,使组织块吸在吸管端部,要避免吸得过高,组织块粘附于吸管壁而丢失。
将组织块均匀排布在培养瓶底部,控制组织块间距在0、5cm左右,每25ml培养瓶底可摆布15～20块。
轻轻翻转培养瓶,使瓶底向上,翻瓶时勿使组织块流动,加入2～3ml培养液(液层厚约15mm),塞好瓶塞,置CO2培养箱37℃培养2～3h,(勿超过4h)。
此时组织块略干燥,能贴附于瓶壁上。
5、培养:慢慢翻转培养瓶,使培养液浸泡附于瓶底的组织块,置培养箱中静止培养。
操作过程中动作一定要轻,减少振动,使培养液慢慢覆盖组织块,否则会使组织块脱落,影响贴壁培养。
6.观察24小时后取出观察,移动培养瓶时要尽量使培养液震荡撞击组织块。
在显微镜下观察已贴壁的组织块有无细胞长出。
消化培养法:1.处死动物、取材及剪切:与组织块培养法相同。
剪切后的组织块再用灭菌的PBS(或Hanks液)清洗数次,直到PBS澄清为止。
移入无菌离心管中,静置数分钟,使组织块自然沉到管底,弃上清。
2.消化及分散组织块按组织块体积5～10倍量,吸取0、25％胰蛋白酶-0、02%EDTA 混合消化液加到含组织块的无菌离心管中,与组织块混匀后,加盖无菌塞子密封,置37℃水浴中消化10～20min,其间每5min摇动一次,使组织块散开并与消化液充分接触。
当组织块变得疏松、颜色略白时,从水浴中取出离心管,在超净工作台内静置后吸去含胰蛋白酶的上清(此步骤可以在800～1000rpm离心3～5min去除含胰蛋白酶的上清),加入2～3ml培养液,终止消化。
用吸管反复吹打,直到大部分组织块分散成单细胞或细胞团状态为止。
最后将此细胞悬液用100目、200目的不锈钢滤网过滤至烧杯中。
3计数及稀释:从过滤的细胞悬液中取1ml,用血细胞计数板计数。
根据计数结果,用培养液稀释,稀释后的细胞密度以5×105～1×106为宜。
4.接种培养:将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中,一般25ml小方瓶分装4～5ml,青霉素瓶分装1ml。
培养瓶上做好标记,培养瓶盖旋紧后再松半个螺旋,置CO2培养箱在37℃培养。
5.观察:接种培养后要每日观察培养液就是否污染、颜色变化及细胞生长状况。