生物化学实验-离子交换层析

1、仪器连接
AB
开关
A、 50ml 20mmol/L Tris-HCl，pH7.3缓
冲液
B、 50ml 20mmol/L Tris-HCl，（0.5
mol/L NaCl） pH7.3缓冲液 1.接通各仪器电源，将A,B泵头分别放置
A，B两个溶液瓶中。注意B为含NaCl溶
液。1：缓冲液阀（Buffer valve） 2. 点2：击混电和脑器桌（面M上ixUenri）corn软件图标，打 开软3：件样。品选阀择（SySsatemmplCeovnatrlovel ，）点击OK ，进4：入泵操（作P界u面m。p）点击Connect 3. 在5：操压作力界传面感的器工（具P栏re，ss点u击reMannual Rusne。n出so现r）FlowRate 窗口，调节flowrate 为 61：ml清/m洗in，阀确（定Wa。sh valve）
Wash valve Collector
（1）连接混和器及样品阀，流速调整为1.0ml/min （2）切换至BufferB，直至Conductivity到达40mS/cm （3）连通BufferA，直至Conductivity接近2并平稳 ，准备装柱
3、装柱和平衡： （1）检查层析柱的两端接头，底端有膜的置于下方。 （2）程序暂停。将层析柱放入卡槽，上端接头与混合器（mixer) 相连，下端接头与样品阀（sample valve)相连。
实验器材与仪器
1、高速冷冻离心机 2、层析柱（φ1.0×20㎝ ）(1支/组） 3、ÄKTATM start（1套/组） 4、部分收集器及收集试管（4ml/管）（1台/组） 5、－20℃冰箱（保存样品用） 6、微量移液枪 200ul、1000ul 7、1.5ml离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用） 8、7ml离心管（留样品Ⅳ用） 9、恒温水浴（50℃、100℃） 10、试管、移液管、试管架等
酶活反应是在试管里操作，并非收集管！！
6、蔗糖酶活力检测
空白对照（1） 样品管（n）
0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5
0.5ml
0.5ml
5%蔗糖溶液
0.5ml
0.5ml
蒸馏水
1.0ml
0.95ml
部分收集的酶液
/
0.05ml
50℃水浴5min
3.5－二硝基水杨酸试剂(DNS)
1.0ml
1.0ml
4、加样：
凝胶柱床平衡约30分钟后，待缓冲液液面与胶体表面相切时，
程序暂停pause。旋开柱上方接头，用胶头滴管缓慢将蔗糖酶蛋
白样品溶液（样品Ⅲ）加入层析柱中，注意顺着柱壁滴加，尽可
能保持胶面平整。启动程序，使样品溶液进入胶体，待样品溶液
完全进入胶体后，暂停程序，用少量洗脱缓冲液将残余在层析柱
壁上端的样品洗下，并完全进入胶体后，再加缓冲液至一定高度，
2、酶活力检测 蔗糖酶是一种水解酶，它能蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原
糖）。（50℃水解） 3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一
定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。（100℃显色）
实验材料与试剂
1、实验材料 蔗糖酶粗分离纯化（溶解即为样品Ⅲ）
2、实验试剂 ⑴ DEAE-Sepharose Fast Flow ⑵ 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液 ⑶ 20mmol/L Tris-HCl（1mol/L NaCl）pH7.3缓冲液 ⑷ 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5 ⑸ 5%蔗糖溶液 ⑹ 3，5-二硝基水杨酸试剂
7：上样阀（Injection valve）
8：UV
9：电导（Conductivity）
10：出口阀（Outlet valve）
Buffer valve
Conductivity
UV Column
Mixer
Injection valve
Outlet valve
Sample valve
Pump Pressure sensor
少量缓冲液
凝胶搅匀后灌入，待其自 然沉降。若凝胶高度未达 要求，需多次灌入。
4cm
DEAE-Sepharose Fast Flow
达到所需柱床高 度后，将柱上端 接头与柱连接， 开始平衡。
装柱（10min后开泵，1 ml/min）
平衡（流速在1.0 ml/min）
样品处理： （1）上次沉淀样品充分溶解于10ml(2*5ml) （20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液,合并为一管，两组平衡。 （2） 4℃ 12000r/min, 离心10分钟，收集上清，测量体积 V3，留取1ml（样品Ⅲ）用于后续分析 （3）将其余样品作离子交换柱层析进一步分离纯化蔗糖酶
100℃水浴2min
蒸馏水
5.0ml
5.0ml
观察颜色
ห้องสมุดไป่ตู้ • 测量：V3 V4 • 留样：样品III 样品IV
洗脱曲线要体现在实验报告里面。
下次实验
盖上柱上方接头。再次启动程序。
样品
缓冲液
5、洗脱（梯度洗脱法）： （1）加样后，先用A缓冲液进行洗脱，洗去未被凝胶吸附的杂蛋白 （20min左右）； （2）待层析柱流出液在仪器上绘出的基线稳定，在程序主界面的工具栏 Manual→Execute manual instruction → pumps →Gradient,在两个框 内均填入100，点击insert，最后点击execute.开始梯度洗脱。每2min接 一管，当Conductivity上升至8 mS/cm 时，开始测定各管的蔗糖酶活力； （3）将蔗糖酶活力高的若干管酶液（2-3管）合并，测量总体积V4（样品 Ⅳ），样品用7ml离心管－20℃保存。
实验二
离子交换柱层析分 离纯化蔗糖酶
实验目的和要求
1、学习离子交换层析的基本原理 2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术 3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法
实验基本原理
1、离子交换层析
由于蔗糖酶的pI偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液的环境中，粗 分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以 先与蔗糖酶样品可逆交换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提 高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子 交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一 被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。