重组蛋白的表达系统(详细版) ppt课件
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常用E. coli表达菌株
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1.2 质粒载体
• 大肠杆菌表达系统采用质粒为表达载体，质粒上的重要 元件包括复制子，启动子，终止子，多克隆位点，信号 肽，融合标签，筛选标记等（图1）。原核表达载体已 经发展得比较完善，有多种质粒可供选择(表4)。
• 复制子： • 复制子决定着质粒载体在宿主中的拷贝数。通常情况下
• P突在L、变42c体s℃p菌A时启株诱动中导子，重使P组L宿等蛋主启白菌动表能子达够使；进得cs行宿pA温主启度在动依3子0赖℃则型时被的抑高表制温达重（。组37在蛋℃温白）度表抑敏达制感，，型而低 温（10℃）启动。温度诱导型的启动子避免了诱导剂的引入，降低了 使用成本，同时也降低了诱导剂对细胞的伤害。
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图1：大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱及多克隆位点
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• 早期大肠杆菌表达体系中，常见的启动子是lac和lacUV5。lac是一个弱 启动子，很难使外源基因得到高表达。目前使用的含有需要小量共表 达的蛋白(如分子伴侣，蛋白抑制剂等)的载体，有很多都采用了经典 的lac启动子。
• 启动子受细胞类型的限制，在不同的细胞系中 有很大不同，因此需根据宿主细胞（尤其是真 核宿主）的类型选择不同的启动子以便于目的 基因的高效表达。
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• 融合标签： • 融合标签是与目的蛋白共表达的一段多肽，方便重组蛋白的纯化、固定和检测，表3给出了常用的重组
标签。如果不需要对重组蛋白进行纯化，尽量不要引入融合标签，以免影响蛋白性质；如果重组蛋白本 身能够结合某种亲和柱，如某些金属结合蛋白可以结合Ni-NTA，某些糖结合蛋白能够特异识别糖类，也 不必引入标签。 • 融合标签的引入能够大大简化重组蛋白的纯化流程，并提高蛋白溶解度。商业化表达质粒，如pET、 pGEX等提供了各种纯化标签和融合蛋白供选，应根据蛋白具体情况进行选择。 • His-tag是最常用的纯化标签，它具有很多优点：标签较短（10-20个氨基酸残基），不带电（pH8.0）， 免疫原性差，通常不影响重组蛋白的结构和功能，Ni2+亲和力高，能够通过一步纯化达到60%-90%的纯 度。 • 如果蛋白质溶解度不高，导致折叠困难、表达量低，可以选择较大的融合标签（GST、MBP、Trx等）帮 助重组蛋白表达和折叠，提高重组蛋白溶解度，从而提高表达量。较大的融合标签有时也会导致翻译困 难甚至提前中止，纯化后发现大部分都是标签蛋白也是常见现象。翻译的提前中止会大大影响重组蛋白 产率和后续纯化，所以在短标签能够达到目的的时候，尽量不要选择大的融合标签。 • 标签位置的选择也很重要：N端标签（短的或长的）自身带有启动子和适应宿主偏好的密码子，可以帮 助目的蛋白表达，提高表达量，但是提前中止翻译的蛋白片段也会被一并纯化出来，降低重组蛋白纯度， 对蛋白酶敏感的、自身容易降解的以及一级序列中有集中的疏水残基区的蛋白尤其要避免使用N端标签； C端标签则可以保证只有完整蛋白得到纯化。另外，如果蛋白的近N端或近C端有重要功能区，如酶活中 心、配体结合位点、二硫键、多聚体稳定界面、相互作用界面等，则要避免纯化标签位于该末端，以免 影响重组蛋白的结构和功能。
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• 终止子： • 转录终止子按照是否依赖和不依赖ρ因子的作
用分为两类，这两类终止子均在终止点前含有 一段7-20bp的回文序列。终止子可以保护 mRNA在核外不被降解，显著延长mRNA的寿命， 由此提高重组蛋白的表达量。但是对于T7系统 来说，由于T7 RNA聚合酶效率极高，宿主中随 时都有充足的mRNA以供翻译，因此大部分在 T7系统中表达的重组蛋白并不在意质粒上是否 有终止子，只有一些自身带有翻译起始信号的 外源基因需要终止子。
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1.1 表达菌株
• 原核表达系统刚用的宿主菌有E. coli，Bacillus等。其中革兰式阳 性的Bacillus更适宜在其周质空间分泌表达重组蛋白；革兰氏阴 性的E. coli能够广谱表达异源蛋白。
• 大肠杆菌表达系统是目前发展最完善的重组蛋白表达系统。常 用大肠杆菌菌株有BL21（DE3）、BL21（DE3）Star、B834（DE3） 等，这些菌株都敲除了蛋白酶，并溶源了噬菌体DE3。DE3是的 一种衍生λ噬菌体，带有噬菌体21抗性区和 lacI基因，lacUV5启 动子，以及 T7 RNA聚合酶基因。这一区段被插入int基因，因此 阻止了DE3在没有辅助噬菌体时整合到染色体上或从染色体切 出。一旦形成DE3溶原状态，就只有受IPTG诱导的lacUV5启动子 指导T7 RNA聚合酶基因转录，在溶原培养体系中加入IPTG诱导 T7 RNA聚合酶生产，继而质粒上的目的DNA开始转录。同时， 还有一些特殊设计的菌株以表达有特殊需要的重组蛋白，如甲 硫氨酸营养缺陷型表达硒代甲硫氨酸蛋白，溶解性增强的菌株 表达毒性蛋白，补充了稀有密码子的菌株表达真核蛋白等，表2 给出了常用的大肠杆菌表达菌株。
质粒拷贝数越高，重组蛋白的表达量就越高，但是高拷 贝的质粒也会严重影响宿主的生长，质粒本身也不稳定， 容易丢失和突变。克隆载体常采用拷贝数低、严谨复制 的复制子，如pSC101；表达载体通常选用高拷贝的复制 子，如pCoE1，pMBI（pUC），等。如果需要进行多个 质粒的共转化，就要根据复制子的相容性选用不同复制 系统的复制子，如pSC101和pUC共表达。
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• 启动子：
• 表达重组蛋白时，我们需要考虑启动子的强弱、 作用方式、调控方式和本底表达水平。表达载 体通常选用强启动子以提高表达量，但弱启动 子也有其优点，如降低本底表达、增加可溶表 达、表达小量伴侣蛋白等。按照作用方式，启 动子可以分为两类：组成型表达的启动子使宿 主不停地表达重组蛋白，常用于工业生产，如 σS等；诱导型表达的启动子使宿主仅在受到诱 导（诱导剂、温度等）时表达目的蛋白，诱导 型启动子使重组蛋白的表达容易控制，同时降 低了外源蛋白对细菌生长的影响。
• 强启动子中，tac和trc是lac启动子的变体，其重组蛋白产率能够达到 细胞总蛋白量的15-30%。araBAD启动子的诱导剂是便宜无毒的L-阿拉 伯糖，本底表达量低，启动能力比tac稍弱。T7则是目前原核表达系统 中最高效的启动子，pET表达系统即是以它为中心构建的。T7启动子 来源于λ噬菌体，专一与T7启动子结合的T7 RNA聚合酶则被整合在宿 主菌的基因组中。在λ噬菌体溶源的表达宿主菌，如BL21（DE3）中， lacI抑制T7 RNA聚合酶的表达，IPTG的加入可以解除这种抑制。当受到 诱导时，T7 RNA聚合酶开始表达并结合在T7启动子上，启动重组蛋白 的表达。T7 RNA聚合酶活性很高，转录速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5 倍，使其下游的重组蛋白得到高效表达，其产率可以达到细菌总蛋白 量的50%以上。T7lac启动子则在T7启动子下游加入了一个lac操纵子， 其中带有一个常规启动子和lac阻遏蛋白的编码序列。lac阻遏蛋白可以 抑制宿主合成T7 RNA聚合酶，并阻断T7 RNA聚合酶导致的目的基因转 录，从而降低重组蛋白的本底表达水平。
重组蛋白表达系统
• 1.原核表达系统 • 2.酵母表达系统 • 3.昆虫细胞表达系统 • 4.哺乳动物细胞表达系统 • 5.转基因植物表达系统 • 6.转基因动物表达系统 • 7.表达系统的选择
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1
一、 原核表达系统
• 原核表达系统发展完善、流程简单快速、 成本低、产量高，对大部分蛋白来说都值 得一试，尤其适宜于表达原核来源的以及 不需要翻译后修饰的真核蛋白。
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1.2 质粒载体
• 大肠杆菌表达系统采用质粒为表达载体，质粒上的重要 元件包括复制子，启动子，终止子，多克隆位点，信号 肽，融合标签，筛选标记等（图1）。原核表达载体已 经发展得比较完善，有多种质粒可供选择(表4)。
• 复制子： • 复制子决定着质粒载体在宿主中的拷贝数。通常情况下
• P突在L、变42c体s℃p菌A时启株诱动中导子，重使P组L宿等蛋主启白菌动表能子达够使；进得cs行宿pA温主启度在动依3子0赖℃则型时被的抑高表制温达重（。组37在蛋℃温白）度表抑敏达制感，，型而低 温（10℃）启动。温度诱导型的启动子避免了诱导剂的引入，降低了 使用成本，同时也降低了诱导剂对细胞的伤害。
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图1：大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱及多克隆位点
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• 早期大肠杆菌表达体系中，常见的启动子是lac和lacUV5。lac是一个弱 启动子，很难使外源基因得到高表达。目前使用的含有需要小量共表 达的蛋白(如分子伴侣，蛋白抑制剂等)的载体，有很多都采用了经典 的lac启动子。
• 启动子受细胞类型的限制，在不同的细胞系中 有很大不同，因此需根据宿主细胞（尤其是真 核宿主）的类型选择不同的启动子以便于目的 基因的高效表达。
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• 融合标签： • 融合标签是与目的蛋白共表达的一段多肽，方便重组蛋白的纯化、固定和检测，表3给出了常用的重组
标签。如果不需要对重组蛋白进行纯化，尽量不要引入融合标签，以免影响蛋白性质；如果重组蛋白本 身能够结合某种亲和柱，如某些金属结合蛋白可以结合Ni-NTA，某些糖结合蛋白能够特异识别糖类，也 不必引入标签。 • 融合标签的引入能够大大简化重组蛋白的纯化流程，并提高蛋白溶解度。商业化表达质粒，如pET、 pGEX等提供了各种纯化标签和融合蛋白供选，应根据蛋白具体情况进行选择。 • His-tag是最常用的纯化标签，它具有很多优点：标签较短（10-20个氨基酸残基），不带电（pH8.0）， 免疫原性差，通常不影响重组蛋白的结构和功能，Ni2+亲和力高，能够通过一步纯化达到60%-90%的纯 度。 • 如果蛋白质溶解度不高，导致折叠困难、表达量低，可以选择较大的融合标签（GST、MBP、Trx等）帮 助重组蛋白表达和折叠，提高重组蛋白溶解度，从而提高表达量。较大的融合标签有时也会导致翻译困 难甚至提前中止，纯化后发现大部分都是标签蛋白也是常见现象。翻译的提前中止会大大影响重组蛋白 产率和后续纯化，所以在短标签能够达到目的的时候，尽量不要选择大的融合标签。 • 标签位置的选择也很重要：N端标签（短的或长的）自身带有启动子和适应宿主偏好的密码子，可以帮 助目的蛋白表达，提高表达量，但是提前中止翻译的蛋白片段也会被一并纯化出来，降低重组蛋白纯度， 对蛋白酶敏感的、自身容易降解的以及一级序列中有集中的疏水残基区的蛋白尤其要避免使用N端标签； C端标签则可以保证只有完整蛋白得到纯化。另外，如果蛋白的近N端或近C端有重要功能区，如酶活中 心、配体结合位点、二硫键、多聚体稳定界面、相互作用界面等，则要避免纯化标签位于该末端，以免 影响重组蛋白的结构和功能。
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• 终止子： • 转录终止子按照是否依赖和不依赖ρ因子的作
用分为两类，这两类终止子均在终止点前含有 一段7-20bp的回文序列。终止子可以保护 mRNA在核外不被降解，显著延长mRNA的寿命， 由此提高重组蛋白的表达量。但是对于T7系统 来说，由于T7 RNA聚合酶效率极高，宿主中随 时都有充足的mRNA以供翻译，因此大部分在 T7系统中表达的重组蛋白并不在意质粒上是否 有终止子，只有一些自身带有翻译起始信号的 外源基因需要终止子。
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1.1 表达菌株
• 原核表达系统刚用的宿主菌有E. coli，Bacillus等。其中革兰式阳 性的Bacillus更适宜在其周质空间分泌表达重组蛋白；革兰氏阴 性的E. coli能够广谱表达异源蛋白。
• 大肠杆菌表达系统是目前发展最完善的重组蛋白表达系统。常 用大肠杆菌菌株有BL21（DE3）、BL21（DE3）Star、B834（DE3） 等，这些菌株都敲除了蛋白酶，并溶源了噬菌体DE3。DE3是的 一种衍生λ噬菌体，带有噬菌体21抗性区和 lacI基因，lacUV5启 动子，以及 T7 RNA聚合酶基因。这一区段被插入int基因，因此 阻止了DE3在没有辅助噬菌体时整合到染色体上或从染色体切 出。一旦形成DE3溶原状态，就只有受IPTG诱导的lacUV5启动子 指导T7 RNA聚合酶基因转录，在溶原培养体系中加入IPTG诱导 T7 RNA聚合酶生产，继而质粒上的目的DNA开始转录。同时， 还有一些特殊设计的菌株以表达有特殊需要的重组蛋白，如甲 硫氨酸营养缺陷型表达硒代甲硫氨酸蛋白，溶解性增强的菌株 表达毒性蛋白，补充了稀有密码子的菌株表达真核蛋白等，表2 给出了常用的大肠杆菌表达菌株。
质粒拷贝数越高，重组蛋白的表达量就越高，但是高拷 贝的质粒也会严重影响宿主的生长，质粒本身也不稳定， 容易丢失和突变。克隆载体常采用拷贝数低、严谨复制 的复制子，如pSC101；表达载体通常选用高拷贝的复制 子，如pCoE1，pMBI（pUC），等。如果需要进行多个 质粒的共转化，就要根据复制子的相容性选用不同复制 系统的复制子，如pSC101和pUC共表达。
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• 启动子：
• 表达重组蛋白时，我们需要考虑启动子的强弱、 作用方式、调控方式和本底表达水平。表达载 体通常选用强启动子以提高表达量，但弱启动 子也有其优点，如降低本底表达、增加可溶表 达、表达小量伴侣蛋白等。按照作用方式，启 动子可以分为两类：组成型表达的启动子使宿 主不停地表达重组蛋白，常用于工业生产，如 σS等；诱导型表达的启动子使宿主仅在受到诱 导（诱导剂、温度等）时表达目的蛋白，诱导 型启动子使重组蛋白的表达容易控制，同时降 低了外源蛋白对细菌生长的影响。
• 强启动子中，tac和trc是lac启动子的变体，其重组蛋白产率能够达到 细胞总蛋白量的15-30%。araBAD启动子的诱导剂是便宜无毒的L-阿拉 伯糖，本底表达量低，启动能力比tac稍弱。T7则是目前原核表达系统 中最高效的启动子，pET表达系统即是以它为中心构建的。T7启动子 来源于λ噬菌体，专一与T7启动子结合的T7 RNA聚合酶则被整合在宿 主菌的基因组中。在λ噬菌体溶源的表达宿主菌，如BL21（DE3）中， lacI抑制T7 RNA聚合酶的表达，IPTG的加入可以解除这种抑制。当受到 诱导时，T7 RNA聚合酶开始表达并结合在T7启动子上，启动重组蛋白 的表达。T7 RNA聚合酶活性很高，转录速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5 倍，使其下游的重组蛋白得到高效表达，其产率可以达到细菌总蛋白 量的50%以上。T7lac启动子则在T7启动子下游加入了一个lac操纵子， 其中带有一个常规启动子和lac阻遏蛋白的编码序列。lac阻遏蛋白可以 抑制宿主合成T7 RNA聚合酶，并阻断T7 RNA聚合酶导致的目的基因转 录，从而降低重组蛋白的本底表达水平。
重组蛋白表达系统
• 1.原核表达系统 • 2.酵母表达系统 • 3.昆虫细胞表达系统 • 4.哺乳动物细胞表达系统 • 5.转基因植物表达系统 • 6.转基因动物表达系统 • 7.表达系统的选择
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一、 原核表达系统
• 原核表达系统发展完善、流程简单快速、 成本低、产量高，对大部分蛋白来说都值 得一试，尤其适宜于表达原核来源的以及 不需要翻译后修饰的真核蛋白。