蛋白免疫印迹(Western Blot)

1.4.9 细胞裂解液

50mM Tris-Cl (pH 8.0) ，1% NP-40， 150mM NaCl，0.5%去氧胆酸钠及0.1% SDS

1.4.10 PMSF储存液（100mmol/L）

称取PMSF17.4mg,溶于1ml异丙醇，分装后储存于－20℃。

1.4.11 5×Tris甘氨酸电泳缓冲液

去离子水 500ml，Tris碱 15.1g，甘氨酸 94g，10%(w/v)电泳级SDS 50ml，补去离子水至1000ml，使用前做5×稀释。

1.4.12转膜缓冲液

Tris碱 3.03g，甘氨酸 14.4g，甲醇 200ml，补ddH2O 至1000ml , 每次配完可用2～3 次，现用现配。4℃避光保存。

1.4.13 1.5MTris－HCl(PH8.8)

Tris碱18.17g,ddH2O 80ml,浓HCL调PH8.8，定容100ml。

1.4.14 1.0MTris－HCl（PH6.8）

Tris碱12.11g,ddH2O 80ml,浓HCL调PH6.8，定容100ml。

1.4.15 10%SDS

SDS 10g，ddH2O定容100ml。

1.4.16 30%丙烯酰胺（29：1）

丙烯酰胺 29g，N，N’-Y亚甲双丙烯酰胺1g，温热去离子水分别溶解上述后,再补去离子水至100ml.滤纸过滤,储于棕色试剂瓶中,4℃保存一月。

1.4.17 10×TBST缓冲液

浓度为100mmol/L Tris-HCl pH 8.0；1500 mmol/L NaCl；

0.2%Tween-20，补水至1000ml. 高压灭菌，4℃保存，使用前再做10 倍稀释。

1.4.18 封闭液（5%脱脂奶粉）

脱脂奶粉 5g，1×TBST 80ml,充分溶解后补1×TBST 至100ml。

1.4.19 10%过硫酸胺APS（4℃避光保存）

APS 10g，ddH2O定容100ml。应隔周新鲜配制。

3 蛋白免疫印迹(Western Blot)

原理：Western blot 印迹方法，又称免疫印迹，是将获得的蛋白样品通过SDS-聚丙烯酰胺（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离，并通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物（硝酸纤维素膜或PVDF膜）上，用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进行特异性结合，再与经辣根过氧化酶标记（偶联）的二抗结合，最后用ECL试剂检测。如果印迹膜上含有靶蛋白，经X 光片曝光显影后，则会在X光片上出现特异性蛋白条带。

3.1 样品制备

3.1.1 取对数生长期的Kasumi-1细胞分别加入不同浓度VPA处理不同时间，800rpm，5min,离心收集细胞。同时设空白对照组。

3.1.2 彻底去除上清，加入适量细胞裂解液并加入PMSF(使PMSF终浓度为0.174mg/ml)，冰上作用40min，期间间断充分混合5～6次。

3.1.3 12000rpm，4℃离心20min，取上清，转入新的Eppendorf 管中，-80℃保存。

3.2 蛋白质浓度测定

3.2.1 蛋白定量采用BCA法

原理：在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA 与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在570nm处有高的吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。

3.2.2 工作溶液及标准蛋白溶液配制

将50体积BCA reagent与1体积Cu reagent 混合即为工作溶液。用PBS与待测蛋白样品匹配之缓冲液进行倍比稀释：20ul4000ug/mlBSA+20ul稀释溶液（PBS）=40ul（BSA=2000ug/ml），取20ul连续倍比稀释7次，得到BSA标准溶液2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625ug/ml，各20ul。

3.2.3 微板测定

将20ul标准品和待测样本与200 ul工作溶液混合；37℃30min 孵育;将反应微板温度冷却至室温；测定570nm光密度（OD）值。

3.2.4 绘制标准曲线（Fig 24）。

X轴为BSA标准蛋白浓度（ug/ml），Y轴为各标准管对应OD570nm 值。用Excel拟合曲线并计算蛋白浓度。

3.3 蛋白变性

恒温水浴箱加热至98℃，取出保存于-80℃冰箱的蛋白样品，按比例（4：1）加入5×Loading Buffer,封好EP管口，至水浴箱中变性10分钟。

3.4 蛋白电泳

3.4.1 按下表分别配制分离胶和浓缩胶。APS和TEMED最后再加。

试剂12%分离胶

（10ml）

6%分离胶

（10ml）

5%浓缩胶

（5ml）

30%凝胶储备液 4.0 2.0 0.67

分离胶缓冲液

（1.5M Tris-HCl）

2.5 2.5 0

浓缩胶缓冲液

（1.0M Tris-HCl）

0 0 0.5

10%SDS 0.1 0.1 0.04

双蒸水 3.3 5.3 2.7

10%APS 0.1 0.1 0.04

1%TEMED 0.004 0.008 0.004

3.3.2 分离胶溶液加至电泳板中，在上面铺上水层，以隔绝空气。

3.3.3 待凝固后，倾去上面的水层。迅速加入浓缩胶，小心插入梳子，避免混入气泡。

3.3.4 待浓缩胶聚合完全后，在电泳槽中加入电泳缓冲液，小心移出梳子，加入已变性并混有溴酚蓝的蛋白样品，进行稳压电泳（浓缩胶，80V；分离胶，120V）。

3.4 转膜

3.4.1 根据凝胶大小剪取6张滤纸和1张PVDF膜（PVDF膜于甲醇中浸泡5min），然后将滤纸、PVDF膜及凝胶于转移缓冲液中处理15分