荷叶黄酮的提取和纯化工艺研究_蔡敏
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432000；2．孝感市西城高级中学，湖北 孝感 432000）
摘 要 ：研 究 孝 感 本 地 生 长 的 荷 叶 ，通 过 超 声 波 辅 助 乙 醇 提 取 法 ，获 得 荷 叶 黄 酮 的 粗 提 物 ，再 采 用 HPD－
450、HPD－600、HPD－826 3 种不同大孔吸附树脂进行分离纯化， 通过静态吸附－解吸试验对 3 种树脂的
%
比 （B ）
℃
h
1
50
1∶20
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1∶40
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1．3．3 大 孔 吸 附 树 脂 静 态 吸 附 试 验 主 要 采 用 HPD－450、HPD－600、HPD－826 3 种 树 脂 进 行 静 态 吸附和解吸试验，3 种树脂均为白色不透明球状颗 粒，它们的性能指标见表 2。 用电子天平准确称取已 经预处理好的 3 种树脂各 1 g，分别放入 3 个干净的 150 mL 的具塞锥形瓶，取荷叶黄酮提取液 70 mL 于 烧杯，再准确量取 60％乙醇 140 mL 加入烧杯，在每 个 150 mL 的锥形瓶 中加入稀释 后的提取 液 40 mL （测得 pH 为 6．5），在不改变提取液 pH 的条件下，放 入 恒 温 振 荡 器 中 （30 ℃，180 r ／ min）静 态 吸 附 ，然 后 每间隔 1 h 测定锥形瓶上清液中黄酮的浓度。 方法如 下：分别用 3 个移液管，在每个移液管贴上标签，准 确量取锥形瓶上清液 1 mL 于 3 个 25 mL 的小烧杯， 测定方法同标准曲线。 测定得到其吸光度，带入回 归方程公式即可得到锥形瓶中上清液黄酮的浓度。
2206988325＠qq．com ；通 信 作 者 ，李 长 春 （1976－ ）， 湖 北 广 水 人 ，（ 电 子 信 箱 ）lcc386＠163．com 。
5692
湖 北 农 业 科学
2015 年
吸光度 A
叶 黄 酮 进 行 分 离 纯 化 。 ［7，8］ 并 且 在 此 基 础 上 探 讨 了 pH、乙 醇 体 积 分 数 、恒 温 振 荡 器 的 温 度 、 转 速 对 大 孔 吸附树脂吸附率和解吸率的影响 。 ［9，10］
物质。 延玺等［6］通过研究发现黄酮类化合物具有多 种生理功能和抵抗疾病的作用。
通过研究孝感本地生长的荷叶，在试验室条件 下对荷叶黄酮类粗提物提取工艺研究的基础上，使 用 大 孔 吸 附 树 脂 HPD－450、HPD－600、HPD－826 对 荷叶黄酮类粗提物的分离纯化效果优化，采用静态 吸附—解吸试验和动态吸附—解吸试验相结合的 研究方法，获得静态吸附曲线、吸附率和解吸率，通 过比较 3 种树脂的各种参数，选出适当的树脂对荷
Abstract： The lotus leaf of Xiaogan local growth was studied． The total lotus leaf flavonoids were obtained by ethanol ultrasonic assisted extraction． Three different macro porous absorption resin of HPD－450， HPD－600 and HPD－826 were used to separate and purify the flavonoids． Three kinds of resin purification process were optimized by static adsorption-desorption experiment． The result showed that the adsorption quantity of three kinds of resin were 95 mg ／ g， 98 mg ／ g， 112 mg ／ g， the adsorption rate were 39.38％， 40.66％， 46．89％ and the desorption rate were 50％ ， 70％， 56％ for HPD－600， HPD－450 and HPD－826 respectively under the conditions of pH 6．5， temperature 30 ℃， thermostatic oscillator in the speed of 180 r ／ min． The effects of temperature and the pH on dynamic adsorption were discussed． Therefore， macroporous resin of HPD－826 was suitable to refine lotus leaf flavonoids． Key words： lotus leaf； flavonoids； macroporous absorption resin； extraction and purification
1 材Biblioteka Baidu与方法
1．1 试验材料 新鲜荷叶分 别于 7 月、8 月和 9 月 采 集 于 孝 感
后湖公园中本土生长的荷叶品种。 将采集的荷叶用 电热鼓风干燥箱在 70 ℃下烘 8 h， 中草药粉碎机粉 碎，用 60 目筛子重复筛选 3 次得到荷叶粉末，装袋 密封，放置冰箱内，备用 。 ［11］ 1．2 试剂与设备
收 稿 日 期 ：2015－08－14 基 金 项 目 ：特 色 果 蔬 质 量 安 全 控 制 湖 北 省 重 点 实 验 室 开 放 项 目 （2014K01）；湖 北 工 程 学 院 科 研 项 目 （Z2013002；201617） 作者简介：蔡 敏（1978－），女，湖北汉川人，讲师，硕士，主要从事新资源食品开发与利用方面的研究，（电话）13972642862（电子信箱）
按照下列算式计算出各种树脂的静态吸附量 （mg ／ g）：
第 54 卷第 22 期 201第5 年22 1期12 月
湖北农业科学 Hubei Agricultural Sciences
VVooll．． 5544 NNoo..2222 NNoovv..，，22001155
荷叶黄酮的提取和纯化工艺研究
蔡 敏 1a，李长春 1a，毕宏光 1b，唐正宇 1b，方 翔 2 （1．湖北工程学院，a．特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室；b．生物质资源转化利用湖北省协同创新中心，湖北 孝感
1．3．2 正 交 试 验 设 计 以 影 响 荷 叶 黄 酮 提 取 率 的 乙 醇 体 积 分 数 、 料 液 比 （g∶mL， 下 同 ）、 提 取 时 间 和 提 取温度为 4 个影响因素，取各自的 3 个水平进行正 交试验，试验的因素与水平见表 1。
表 1 因素与水平
因素
水平 乙醇体积分数（A） 料液 提取温度（C） 提取时间（D）
DOI：10．14088 ／ j．cnki．issn0439－8114．2015．22．051
Study on Extraction and Purification Process of Flavonoids from Lotus Leaf
CAI Min1a，LI Chang－chun1a，BI Hong－guang1b，TANG Zheng－yu1b，FANG Xiang2 （1． a．Hubei Key Laboratory of Quality Control of Characteristic Fruits and Vegetables； Hubei Engineering University； b．Hubei Co－Innovation
纯化工艺进行选择。 结果表明，在 pH 6．5，温度 30 ℃，转速 180 r ／ min 的恒温振荡器中，HPD－450 的吸附
量 为 95 mg ／ g、吸 附 率 为 39．38％、解吸 率 为 50％，HPD－600 的 吸 附 量 为 98 mg ／ g、吸 附 率 为 40．66％、解 吸
率为 70％，HPD－826 的吸附量为 112 mg ／ g、吸附率为 46．89％、解吸率为 56％。 综合考虑 HPD－826 型大孔
树脂对荷叶黄酮纯化效果最佳，适用于精制荷叶黄酮。
关键词：荷叶；黄酮；大孔树脂；纯化
中 图 分 类 号 ：S682．32 ；R284．2
文 献 标 识 码 ：A
文 章 编 号 ：0439－8114 （2015）22－5691－03
试 剂 ： 芦 丁 标 准 品 （ 贵 州 迪 大 科 技 有 限 公 司 ）； 大 孔 吸 附 树 脂 （沧 州 宝 恩 吸 附 材 料 科 技 有 限 公 司 ）； 无水乙醇、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH 均为分析纯。
设备： 中草药粉碎机 （天津市泰斯特有限公 司 ）；电 热 鼓 风 干 燥 箱 （ 上 海 福 玛 实 验 设 备 有 限 公 司）；电子天平 （赛多利斯科 学仪器有限 公司）；DL－ 480B 型 超 声 波 清 洗 器 （上 海 之 信 仪 器 有 限 公 司 ）； DT5－2 型低速台式离心机（北京时代利离心机有限 公 司 ）；SHZ－III 型 循 环 水 真 空 泵 （上 海 亚 荣 生 化 仪 器厂）；ZHWY－211B 型恒 温振 荡 器 （上 海 智 城 分 析 仪 器 制 造 有 限 公 司 ）；UV－5200 型 紫 外 可 见 分 光 光 度 计 （上 海 元 析 仪 器 有 限 公 司 ）；FE20 型 pH 计 （上 海 梅 特 勒－托 利 多 仪 器 有 限 公 司 ）；TBD－2000 型 中 压 层 析 制 备 系 统 （SHANGHAI TAUTO BIOTECH CO．，LTD．）；Φ5．0×40 型层析柱 （上海沪西分析仪器 厂有限公司）。 1．3 试验方法 1．3．1 芦丁标准曲线的制定 称取 10 mg 芦丁标准 品 ，用 30％乙 醇 标 定 在 50 mL 容 量 瓶 中 ，配 成 浓 度 为 0．200 mg ／ mL 的芦丁溶 液， 再分别取 0、1、2、3、 4、5 mL 于 25 mL 的容量瓶 中， 在每个容 量瓶中加 入 1 mL 5％ 的 NaNO2 振 荡 6 min 后 加 入 l mL 5％ Al（NO3）3，振 荡 5 min，再 加 入 10 mL 10％ 的 NaOH， 定容到刻度线，以空白试剂为参比液，于 510 nm 处 测其吸光度，以吸光度 A 为纵坐标，浓度 C 为横坐 标绘制标准曲线（图 1）。
Center for Utilization of Biomass Waste， Hubei Engineering University， Xiaogan 432000， Hubei， China； 2．The West of Xiaogan Comprehensive Senior Middle School， Xiaogan 432000，Hubei， China）
0.40 0.35 A=0.889 8 C-0.002 3 0.30 R2=0.999 0 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00
0 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 0.040 芦 丁 浓 度 //mg/mL
图 1 芦丁标准曲线
荷叶为睡莲 科（Nymphaeaceae）水 生 植 物 ，资 源 丰富，主要分布在湖北、湖南、安徽、江西、福建、江 苏、山东等省份。 荷叶的化学成分十分复杂，至今已 从荷叶中分离出生物碱、黄酮类化合物等多种主要 化学成分 。 ［1，2］ 研究表明 ，荷叶中含有 以槲皮素为 主 要成分的黄酮类物质，且含量丰富［3］。 张贇彬等［4］从 荷叶中分离出山萘酚和槲皮素－3－丙酯。Elegami 等［5］ 从 荷 叶 中 分 离 出 了 Myricetin－3－（6－p－coumaroyl）－ glucoside，Nympholide A 和 Nympholide B 等黄酮类
摘 要 ：研 究 孝 感 本 地 生 长 的 荷 叶 ，通 过 超 声 波 辅 助 乙 醇 提 取 法 ，获 得 荷 叶 黄 酮 的 粗 提 物 ，再 采 用 HPD－
450、HPD－600、HPD－826 3 种不同大孔吸附树脂进行分离纯化， 通过静态吸附－解吸试验对 3 种树脂的
%
比 （B ）
℃
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1
50
1∶20
60
2
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60
1∶30
70
3
3
70
1∶40
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1．3．3 大 孔 吸 附 树 脂 静 态 吸 附 试 验 主 要 采 用 HPD－450、HPD－600、HPD－826 3 种 树 脂 进 行 静 态 吸附和解吸试验，3 种树脂均为白色不透明球状颗 粒，它们的性能指标见表 2。 用电子天平准确称取已 经预处理好的 3 种树脂各 1 g，分别放入 3 个干净的 150 mL 的具塞锥形瓶，取荷叶黄酮提取液 70 mL 于 烧杯，再准确量取 60％乙醇 140 mL 加入烧杯，在每 个 150 mL 的锥形瓶 中加入稀释 后的提取 液 40 mL （测得 pH 为 6．5），在不改变提取液 pH 的条件下，放 入 恒 温 振 荡 器 中 （30 ℃，180 r ／ min）静 态 吸 附 ，然 后 每间隔 1 h 测定锥形瓶上清液中黄酮的浓度。 方法如 下：分别用 3 个移液管，在每个移液管贴上标签，准 确量取锥形瓶上清液 1 mL 于 3 个 25 mL 的小烧杯， 测定方法同标准曲线。 测定得到其吸光度，带入回 归方程公式即可得到锥形瓶中上清液黄酮的浓度。
2206988325＠qq．com ；通 信 作 者 ，李 长 春 （1976－ ）， 湖 北 广 水 人 ，（ 电 子 信 箱 ）lcc386＠163．com 。
5692
湖 北 农 业 科学
2015 年
吸光度 A
叶 黄 酮 进 行 分 离 纯 化 。 ［7，8］ 并 且 在 此 基 础 上 探 讨 了 pH、乙 醇 体 积 分 数 、恒 温 振 荡 器 的 温 度 、 转 速 对 大 孔 吸附树脂吸附率和解吸率的影响 。 ［9，10］
物质。 延玺等［6］通过研究发现黄酮类化合物具有多 种生理功能和抵抗疾病的作用。
通过研究孝感本地生长的荷叶，在试验室条件 下对荷叶黄酮类粗提物提取工艺研究的基础上，使 用 大 孔 吸 附 树 脂 HPD－450、HPD－600、HPD－826 对 荷叶黄酮类粗提物的分离纯化效果优化，采用静态 吸附—解吸试验和动态吸附—解吸试验相结合的 研究方法，获得静态吸附曲线、吸附率和解吸率，通 过比较 3 种树脂的各种参数，选出适当的树脂对荷
Abstract： The lotus leaf of Xiaogan local growth was studied． The total lotus leaf flavonoids were obtained by ethanol ultrasonic assisted extraction． Three different macro porous absorption resin of HPD－450， HPD－600 and HPD－826 were used to separate and purify the flavonoids． Three kinds of resin purification process were optimized by static adsorption-desorption experiment． The result showed that the adsorption quantity of three kinds of resin were 95 mg ／ g， 98 mg ／ g， 112 mg ／ g， the adsorption rate were 39.38％， 40.66％， 46．89％ and the desorption rate were 50％ ， 70％， 56％ for HPD－600， HPD－450 and HPD－826 respectively under the conditions of pH 6．5， temperature 30 ℃， thermostatic oscillator in the speed of 180 r ／ min． The effects of temperature and the pH on dynamic adsorption were discussed． Therefore， macroporous resin of HPD－826 was suitable to refine lotus leaf flavonoids． Key words： lotus leaf； flavonoids； macroporous absorption resin； extraction and purification
1 材Biblioteka Baidu与方法
1．1 试验材料 新鲜荷叶分 别于 7 月、8 月和 9 月 采 集 于 孝 感
后湖公园中本土生长的荷叶品种。 将采集的荷叶用 电热鼓风干燥箱在 70 ℃下烘 8 h， 中草药粉碎机粉 碎，用 60 目筛子重复筛选 3 次得到荷叶粉末，装袋 密封，放置冰箱内，备用 。 ［11］ 1．2 试剂与设备
收 稿 日 期 ：2015－08－14 基 金 项 目 ：特 色 果 蔬 质 量 安 全 控 制 湖 北 省 重 点 实 验 室 开 放 项 目 （2014K01）；湖 北 工 程 学 院 科 研 项 目 （Z2013002；201617） 作者简介：蔡 敏（1978－），女，湖北汉川人，讲师，硕士，主要从事新资源食品开发与利用方面的研究，（电话）13972642862（电子信箱）
按照下列算式计算出各种树脂的静态吸附量 （mg ／ g）：
第 54 卷第 22 期 201第5 年22 1期12 月
湖北农业科学 Hubei Agricultural Sciences
VVooll．． 5544 NNoo..2222 NNoovv..，，22001155
荷叶黄酮的提取和纯化工艺研究
蔡 敏 1a，李长春 1a，毕宏光 1b，唐正宇 1b，方 翔 2 （1．湖北工程学院，a．特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室；b．生物质资源转化利用湖北省协同创新中心，湖北 孝感
1．3．2 正 交 试 验 设 计 以 影 响 荷 叶 黄 酮 提 取 率 的 乙 醇 体 积 分 数 、 料 液 比 （g∶mL， 下 同 ）、 提 取 时 间 和 提 取温度为 4 个影响因素，取各自的 3 个水平进行正 交试验，试验的因素与水平见表 1。
表 1 因素与水平
因素
水平 乙醇体积分数（A） 料液 提取温度（C） 提取时间（D）
DOI：10．14088 ／ j．cnki．issn0439－8114．2015．22．051
Study on Extraction and Purification Process of Flavonoids from Lotus Leaf
CAI Min1a，LI Chang－chun1a，BI Hong－guang1b，TANG Zheng－yu1b，FANG Xiang2 （1． a．Hubei Key Laboratory of Quality Control of Characteristic Fruits and Vegetables； Hubei Engineering University； b．Hubei Co－Innovation
纯化工艺进行选择。 结果表明，在 pH 6．5，温度 30 ℃，转速 180 r ／ min 的恒温振荡器中，HPD－450 的吸附
量 为 95 mg ／ g、吸 附 率 为 39．38％、解吸 率 为 50％，HPD－600 的 吸 附 量 为 98 mg ／ g、吸 附 率 为 40．66％、解 吸
率为 70％，HPD－826 的吸附量为 112 mg ／ g、吸附率为 46．89％、解吸率为 56％。 综合考虑 HPD－826 型大孔
树脂对荷叶黄酮纯化效果最佳，适用于精制荷叶黄酮。
关键词：荷叶；黄酮；大孔树脂；纯化
中 图 分 类 号 ：S682．32 ；R284．2
文 献 标 识 码 ：A
文 章 编 号 ：0439－8114 （2015）22－5691－03
试 剂 ： 芦 丁 标 准 品 （ 贵 州 迪 大 科 技 有 限 公 司 ）； 大 孔 吸 附 树 脂 （沧 州 宝 恩 吸 附 材 料 科 技 有 限 公 司 ）； 无水乙醇、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH 均为分析纯。
设备： 中草药粉碎机 （天津市泰斯特有限公 司 ）；电 热 鼓 风 干 燥 箱 （ 上 海 福 玛 实 验 设 备 有 限 公 司）；电子天平 （赛多利斯科 学仪器有限 公司）；DL－ 480B 型 超 声 波 清 洗 器 （上 海 之 信 仪 器 有 限 公 司 ）； DT5－2 型低速台式离心机（北京时代利离心机有限 公 司 ）；SHZ－III 型 循 环 水 真 空 泵 （上 海 亚 荣 生 化 仪 器厂）；ZHWY－211B 型恒 温振 荡 器 （上 海 智 城 分 析 仪 器 制 造 有 限 公 司 ）；UV－5200 型 紫 外 可 见 分 光 光 度 计 （上 海 元 析 仪 器 有 限 公 司 ）；FE20 型 pH 计 （上 海 梅 特 勒－托 利 多 仪 器 有 限 公 司 ）；TBD－2000 型 中 压 层 析 制 备 系 统 （SHANGHAI TAUTO BIOTECH CO．，LTD．）；Φ5．0×40 型层析柱 （上海沪西分析仪器 厂有限公司）。 1．3 试验方法 1．3．1 芦丁标准曲线的制定 称取 10 mg 芦丁标准 品 ，用 30％乙 醇 标 定 在 50 mL 容 量 瓶 中 ，配 成 浓 度 为 0．200 mg ／ mL 的芦丁溶 液， 再分别取 0、1、2、3、 4、5 mL 于 25 mL 的容量瓶 中， 在每个容 量瓶中加 入 1 mL 5％ 的 NaNO2 振 荡 6 min 后 加 入 l mL 5％ Al（NO3）3，振 荡 5 min，再 加 入 10 mL 10％ 的 NaOH， 定容到刻度线，以空白试剂为参比液，于 510 nm 处 测其吸光度，以吸光度 A 为纵坐标，浓度 C 为横坐 标绘制标准曲线（图 1）。
Center for Utilization of Biomass Waste， Hubei Engineering University， Xiaogan 432000， Hubei， China； 2．The West of Xiaogan Comprehensive Senior Middle School， Xiaogan 432000，Hubei， China）
0.40 0.35 A=0.889 8 C-0.002 3 0.30 R2=0.999 0 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00
0 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 0.040 芦 丁 浓 度 //mg/mL
图 1 芦丁标准曲线
荷叶为睡莲 科（Nymphaeaceae）水 生 植 物 ，资 源 丰富，主要分布在湖北、湖南、安徽、江西、福建、江 苏、山东等省份。 荷叶的化学成分十分复杂，至今已 从荷叶中分离出生物碱、黄酮类化合物等多种主要 化学成分 。 ［1，2］ 研究表明 ，荷叶中含有 以槲皮素为 主 要成分的黄酮类物质，且含量丰富［3］。 张贇彬等［4］从 荷叶中分离出山萘酚和槲皮素－3－丙酯。Elegami 等［5］ 从 荷 叶 中 分 离 出 了 Myricetin－3－（6－p－coumaroyl）－ glucoside，Nympholide A 和 Nympholide B 等黄酮类