实验——总黄酮含量的测定

《有机分析实验讲义》植物中总黄酮的提取与测定黄酮类化合物主要指以2—苯基色原酮为基核的化合物，主要有黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮、花色素、查尔酮等以及它们的衍生物。其主要结构式如图。

图黄酮类化合物分子结构式

黄酮类化合物主要结构类型见表。

表黄酮类化合物主要结构类型

原理

黄酮母核中含有碱性氧原子,一般又多带酚羟基，能和铝离子产生黄色络合物,又加入亚硝酸钠和氢氧化钠,使在碱性溶液中呈红色，溶液在510 nm 处有最大吸收，显色反应在60 min 内稳定。用芦丁作为对照品，用硝酸铝作为黄酮类比色测定的显色剂，吸光度与芦丁的浓度呈线形关系，采用分光光度法对总黄酮进行了含量测定。

仪器与试剂

新锐T6型紫外可见分光光度计；Explrer型电子天平（0.1mg）。

60%的乙醇溶液；5%亚硝酸钠溶液；10%硝酸铝溶液。

芦丁标准溶液的配制

称量13.2mg 芦丁，用60%乙醇定容到25ml 容量瓶作为标准溶液。

标准曲线的制作

准确吸取0， 0.4， 0.8， 1.2， 1.6，2.0 ml 芦丁标准溶液，放入10毫升容量瓶内（写明标记），分别加入2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0 ml 的60%乙醇溶液；再加入5%亚硝酸钠溶液0.5ml 摇匀，放置6min ；加入10%硝酸铝溶液0.5ml ，放置6min 后；加入4%氢氧化钠溶液4.0ml ，加60%乙醇定容，摇匀后，放置15min ；（扫描找到最大吸收）在510nm 处测定吸光度。用0.0ml 作为空白，用芦丁含量的浓度作为横坐标，纵坐标作为一定浓度下所对应的吸光度，作标准曲线。

3.6.4 总黄酮提取与测定和计算

称取0.6—0.8g 样品粉末，加入60ml60%乙醇放于100ml 圆底烧瓶内，置于水浴锅上，70℃条件下回流提取60min 。过滤、定容于100ml.

吸取样品量（根据样品的吸光度调整）1.0ml ，放入10毫升容量瓶内（写明标记），用60%乙醇加到2.0ml ；加入5%亚硝酸钠溶液0.5ml 摇匀，放置6min ；加入10%硝酸铝，溶液0.5ml ，放置6min 后；加入4%氢氧化钠溶液4.0ml ，摇匀后，加60%乙醇定容，放置15min ；在510nm 处测定吸光度。根据标准曲线计算总黄酮的含量。

总黄酮含量=

M

A 100×稀释倍数 A 为标准曲线中的含量。

例如：

测得的吸光度=0.504 Y=0.0101x+0.0017 A=0101.00017.0-Y =0101

.00017.0504.0-=49.73 M 为样品的质量(mg)