α-淀粉酶产生菌株(细菌)的分离纯化及检测

点 植 （ 接 ） 培 养 后 碘 液 检 测 结 果
D
透 明 圈 及与 比菌 值落 计直 算径 测 量
d
比值=D/d
实验结果
记录稀释平板分离的结果——细菌数、产 淀粉的菌数及所占比例（不一定结果很 好）；——列表（稀释度、菌落数、 CFU/g） 记录点植结果——挑取菌株编号、透明圈 直径、菌落直径，并计算出透明圈、菌落 直径比；——列表（透明圈、菌落、D/d） 根据以上结果完成实验报告； 确定相关菌株（3-5株）保存好，准备进 行下次（组）摇瓶初筛试验。
第二种 分离和检测用平板培养基 ——300mL/组
可溶性淀粉 30g； Na2HPO4 .12H2O 8g； （NH4）2SO4 4g； NH4Cl 1.5g； 3%豆粕粉浸出液 1000mL 琼脂 20g 121.3℃灭菌20分钟 注：如果还想使用自已组的设计培养基或其它培 养基也可以。 每组200mL培养基制备10个平板。
本次实验基本流程
准备工作 灭菌 制备分离 用平板 冷却99mL 无菌水 加入分离 样品振荡
十倍梯度 稀释涂布 平板分离
培养
菌落计数 挑菌点接 平板培养 测量透明 圈及菌落 直径 需要留下 培养 留于以后 的，挑于 实验用 斜面保存
平板点接检测流程 （尽量不要打开平板，无菌操作）
平板底部 “十字”划 分 四区域对 应编号
分离培养基：利用相关含淀粉平板培养基进 行分离（其它成分根据实际需要添加）； 分离方法：采用十倍梯度稀释涂布平板，经 培养后挑取单菌落； 检测方法：利用淀粉遇碘变蓝的性质，平板 加入卢哥氏碘液后，显示淀粉酶扩散水解淀 粉而产生的透明圈情况——透明圈直径与菌 落直径之比判断； 同时可以结合糊化淀粉冷藏后变性透明度 降低，淀粉酶扩散水解淀粉也会产透明圈。
1瓶（带玻珠，装于250ml三角 5支（装于18×180mm试管）
不锈钢涂布器
4支
斜面培养基10支/组（利用分离和检测培养基制 备，全班统一准备，各组分装于15×150mm）
实验步骤、要求及安排
今天完成稀释平板分离培养——倒平板、样品稀 释、加样、涂布、恒温倒置培养（32℃ 4872hr）；——本次室温培养至下周处理。 ——稀释度为10-5、10-6、10-7，每个稀释度 各涂布三皿。 ——称取1g样品加入至99mL无菌水中，充分振 摇后，稀释度为10-2。 ——每皿加样量为0.1或0.2mL。 ——恒温培养前，先室温正置一段时间。 培养后，将培养好的平板放于4℃冰箱过夜，显 示透明圈（淀粉变性，不透明），便于直接观察， 挑出产淀粉酶的菌株；
平板检测所点植接种菌株产淀粉 酶的情况——“透明圈大小”
将已培养好的点植平板内加入少量卢哥氏 碘液，摇动铺满整个平板（也可先冷藏）。 测量菌落及菌落周围透明圈的直径，计算 出透明圈和菌落的比值。 根据透明圈和菌落的比值可以初步判断菌 株产淀粉酶量的高低（不一定和以后液体 发酵结果完全对应？） 选择透明圈和菌落的比值大的菌株准备进 行α-淀粉酶初筛摇瓶液体发酵，确定各菌 株的产酶水平和菌株的稳定性。
实验步骤及安排
根据菌落周围透明圈和形态特征挑单菌落 于斜面（注意编号），并培养保存（也可 以先不挑菌，培养皿背面菌落编号，点植 接种后的培养皿保存冰箱）； 利用接种针点接单菌落于分离和检测用平 板培养基平板上， 32℃培养18~24hr内 检测淀粉酶产生量——测量平板上透明圈、 菌落直径，并计算出比值。
样品平板菌落计数结果
稀释度 10-4 10-5 10-6 10-7
培养皿号
细菌 总数 菌落数 CFU/g 产淀 粉酶 的菌 数— —产 透明 圈的 菌落 培养皿号 菌落数
1
2
3
平 均
1
2
3
平 均
1
2
3
平 均
1
2
3
平 均
1
2
3
平 均
1
2
3
平 均
1
2
3
平 均
1Hale Waihona Puke Baidu
2
3
平 均
CFU/g
产淀粉酶菌株占总 菌数的比例（%）
编号对应 选择依据
1、菌落周围有透明圈 2、菌落粗糙、颗粒感强、 边缘不整齐、有丝状感 （正反面）
32℃培养 24hr
仔细观察 生长菌落
有无透明 圈（有）
选择12个单 菌落，编号
点接于平板 相应区域
加入检测 碘液显色
测量透明圈 和菌落直径
计算D/d比 值（排序）
选择最好 3-4株菌种
划线接种 斜面
培养好后冰 箱保存备用
α-淀粉酶产生菌株（细菌）的 分离纯化及检测
目的要求
了解利用选择性培养基进行α -淀粉酶产生 菌株分离的要求。 掌握α -淀粉酶产生菌株相关分离纯化的方 法步骤——稀释涂布平板菌落分离、挑菌 保存、平板点植、观察测定透明圈等。 学习在平板上进行α -淀粉酶产生菌株的检 测及产酶量初步判断。
基本原理
第一种 分离和检测用平板培养基 ——200mL/组
马铃薯浸液 1000mL 玉米淀粉 10g 琼脂 15g 121.3℃灭菌20分钟 每组200mL培养基制备10个平板（倒之前轻 摇培养基混匀琼脂和淀粉）。
马铃薯浸液的制备
马铃薯洗净后去皮； 称取去皮200g马铃薯加适量水（约 1000mL） 加热煮沸20分钟后，棉布（纱布）过滤， 清液定容至1000mL备用。 加热过程注意补水。
培养2天冷藏后培养皿上菌落的具体 处理——挑单菌落、点植平板
利用平板菌落计数方法进行统计计数。 选择要挑取的单菌落（一般菌落周围有不 是太清晰的透明圈），并给予编号。 利用接种针挑取少量菌体，点植接种于平 板上的相应位置（有编号，对应）。 同时利用接种环将同一个菌落（已点植接 种的）划线接种于PDA（牛肉膏蛋白胨） 斜面上。——此步本次实验不做 将点植接种好的平板（倒置）和斜面于32 ℃培养24-48小时。
注意：不要打开培养皿计数；不要破坏菌落；需要挑取的菌落要编号；挑取 点接完后放入冰箱下次课还要使用。
平板点接步骤及要求
选择稀释度合适的培养平板（单菌落分散），仔 细观察菌落，找出菌落周围有透明圈的菌落，越 大越清晰越好（一般菌落不透明、表面干燥并粗 糙），找好后给其编号（在平板底部玻璃上）。 将平板在底部玻璃上用记号笔划“十”字线分为 四部分。 各部中心用记号笔点一点（底部玻璃上，控制点 接的位置），并在旁侧标记要点接的菌株编号。 用接种针挑取少量菌体（轻戳菌落）点接于平板 相应位置（菌株编号要对应）。 点接好后，平板倒置培养（30-32℃，24-48 小时）。
3%豆粕粉浸出液的制备
称取30g豆粕粉加水1000mL 加热煮沸30分钟后，棉布过滤，清液定容 至1000mL备用。 加热过程注意补水。
实验中器材的准备 （需要包扎灭菌）
平板分离用培养基200mL 三角瓶） 1ml无菌吸管（塞棉花） 99ml无菌水 瓶中） 9ml无菌水 1瓶（装于500mL 7支
记录结果 填表计算
1、测量透明圈直径 2、测量菌落直径 3、计算透明圈与菌落直径比值（D/d） 4、根据D/d值大小排序（挑取4株于 斜面培养后备用）
平板菌落计数
总菌落数 计数 有透明圈 菌落计数
记录结果 填表计算
平板放入 冰箱保存
根据碘液 检测结果
挑取单菌 菌于斜面
清洗干净 平板（字）
1、细菌总数 2、产淀粉酶的菌数 3、产淀粉酶菌株占总菌数的比例
点接平板培养后碘液显色反应结果
菌株编号 透明圈直径 （D，mm） 菌落直径 （d，mm） D/d比值 排序
下次（组）实验
实验内容：α-淀粉酶菌株的初筛发酵及酶 活力的测定 强调： 1、初筛液体发酵培养基配方及培养方法 条件； 2、α-淀粉酶酶活力测定方法及操作步骤 （要相当熟悉）； 3、具体实验时间安排。