动物肝脏中DNA的提取

南京大学医学院生化实验报告———————————————————————————

动物肝脏中DNA的提取

一实验目的

1.学习和掌握用浓盐法从动物组织中提取DNA的原理和技术

2.了解分离提取DNA的一般原理

二实验原理

一、核酸提取的主要步骤：

1.破碎细胞：研磨、组织匀浆、超声波、冻融；一硫氰酸胍、碱裂解；酶解（溶菌酶）

2.除去与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子：酚/氯仿抽提、蛋白质变性（SDS、异硫氰酸胍等）、蛋白酶处理、高盐洗涤

3.除去其他不需要的核酸分子

4.沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质

二、提取DNA的注意事项

1.避免过酸、过碱及高温

2.加入DNA酶抑制剂：柠檬酸、氰化物、砷酸盐、EDTA、SDS、苯酚等

3.蛋白变性剂反映不宜过于剧烈，以防机械张力使核酸链破坏。

4.加入RNA降解酶除RNA

三、DNA的主要来源

1.动物组织及器官：脾、肝、胸腺、鱼类精子等。

2.植物：种子的胚芽等

3.微生物：细菌、酵母菌等

核酸和蛋白质在生物体中以核蛋白的形式存在，其中DNA主要存在于细胞核中，RNA主要存在于核仁及细胞质中。

生物体组织细胞中的脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），大部分与蛋白质结合，以核蛋白——脱氧核糖核蛋白（DNP）和核糖核蛋白（RNP）的形式存在，这两种复合物在不同的电解质溶液中的溶解度有较大差异。在低浓度的

NaCl溶液中，DNP的溶解度随NaCl浓度的增加而逐渐降低，当NaCl浓度达到0.14mol/L时，DNP的溶解度约为纯水中溶解度的1%（几乎不溶）；但当NaCl 浓度继续升高时，DNP的溶解度又逐渐增大，当NaCl浓度增至0.5mol/L时，DNP的溶解度约等于纯水中的溶解度，当NaCl浓度继续增至1.0mol/L时，DNP 的溶解度约为纯水中溶解度的2倍（溶解度很大）。而RNP则不一样，它在浓NaCl溶液和稀NaCl溶液中的溶解度都很大。因此，可以利用不同浓度的NaCl 溶液将DNP和RNP分别抽提出来。在低浓度的NaCl溶液中，DNP的溶解度随NaCl浓度的增加而逐渐降低，当NaCl浓度达到0.14mol/L时，DNP的溶解度约为纯水中溶解度的1%（几乎不溶）；但当NaCl浓度继续升高时，DNP的溶解度又逐渐增大，当NaCl浓度增至0.5mol/L时，DNP的溶解度约等于纯水中的溶解度，当NaCl浓度继续增至1.0mol/L时，DNP的溶解度约为纯水中溶解度的2倍（溶解度很大）。而RNP则不一样，它在浓NaCl溶液和稀NaCl溶液中的溶解度都很大。因此，可以利用不同浓度的NaCl溶液将DNP和RNP分别抽提出来。

将抽提得到的DNP用十二烷基硫酸钠（SDS）处理，DNA即与蛋白质分开，可用氯仿-异丙醇将蛋白质沉淀除去，而DNA溶于溶液中，加入适量的乙醇，DNA即析出，进一步脱水干燥，即得白色纤维状的DNA粗制品。为了防止DNA(或RNA)酶解，提取时加入乙二胺四乙酸(EDTA)。大部分多糖在用乙醇或异丙醇分级沉淀时即可除去。DNA中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应。

制备过程应在低温下（4度）进行，防止过酸，过碱及其他引起核降解的因素。必要时加入酶抑制剂（柠檬酸、EDTA等可以抑制DNA酶活性，SDS或苯酚等蛋白质变性剂可以使核酸降解酶破坏）

动植物的DNA核蛋白能溶于水及高浓度的盐溶液，但在0.14mol/l的盐溶液中溶解度很低，而RNA核蛋白则溶于0.14mol/l盐溶液，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。在核酸分子中，由于磷酸基的存在，使其酸性占优势，DNA或RNA都能溶于水中，而不溶于有机溶剂。用络合剂EDTA抑制核酸水解酶的活力, 同时用去污剂SDS把蛋白质和DNA分开,再用氯仿-异丙醇作为蛋白质的变性剂沉淀蛋白质, 最后用乙醇

把DNA沉淀出来。

三实验器材

1. 捣碎机

2. 离心机

3. 手术剪

4. 离心管

5. 刻度吸管

6. 烧杯（100ml，250ml）

7. 玻棒

8. 新鲜动物肝脏

9.石英比色皿

10.量筒（10ml，100ml）

11.容量瓶（50ml）

四实验试剂

1、0.1mol/LNaCl-0.05mol/L柠檬酸钠溶液（pH6.8）。

2、0.015mol/LNaCl-0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液：氯化钠0.828克及柠檬酸三钠0.341克溶于蒸馏水，稀释至1000ml。

3、95%乙醇（A.R.）。

4、NaCl固体（A.R.）。

5、5%SDS溶液：5gSDS溶于100ml水中。

6、氯仿（A.R.）。

7、V（氯仿）：V（异戊醇）混合液20：1

五实验操作

1）粗提

1．称取猪肝8g于100ml的小烧杯中，用剪刀剪碎，加入2倍重的0.1mol/LNaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液（16ml），高速匀浆。

2．将匀浆液（~25ml）转移到100ml离心管中，在4000r/min下离心10min，弃去上清液。沉淀中继续加入25ml缓冲液，搅拌均匀后于4000r/min离心20min，

取沉淀。

2）分离DNP、除蛋白

3．将上述沉淀转移至250ml烧杯中，加入40ml0.1mol/LNaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液、21ml氯仿/异戊醇、4ml5%SDS，用保鲜膜封口，振摇30min。

4．缓慢加入3.6gNaCl（事先在研钵中研成粉末）使体系终浓度为1mol/L。将混合液转移至离心管中于3500r/min离心20min，取上清水相（用滴管吸取并量体积）。

3）沉淀DNA

5．在水相中加入等体积95%乙醇，边加边用玻璃棒朝一个方向慢慢搅动直至溶液澄清，将DNA凝胶缠绕在玻璃棒上，用滤纸吸去多余的乙醇，得DNA粗品。【注】用玻棒缠绕DNA有困难时，亦可缓慢摇动烧杯以助于DNA聚集。6．将DNA粗品用5mmol/L NaOH溶解并定容至50ml，作为待测样品。

六注意事项

1、匀浆（破碎细胞）要充分，需剪成小块。

2、固体NaCl应磨碎，加入应分批慢慢加入，且边加边摇，避免局部浓度过大或未及溶解而沉入氯仿层。

3、变性蛋白质层易散，吸取上清液时应仔细，不要将蛋白质及下层的氯仿吸入。

4、实验结束后将变性蛋白质（肝糜）小心取出置于专用废物袋中，氯仿倒入回收瓶内。