基因工程实验课(2) 生化实验PPT技术文档

0.7
20000—1000
1.4
6000—300
3-18
聚丙烯酰胺凝胶电泳
优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。
琼脂糖凝胶电泳：1000—50000bp
聚丙烯酰胺凝胶电泳：1—1000bp
聚丙烯酰胺凝胶浓度 （%）
4.0 10.0 20.0
分离DNA片断大小 （bp）
1000—100 500—25 50—1
基因工程实验课（2）
康康、吉坤美、钱民先、徐亚菲
基因工程流程
第一次课程： 1. 质粒的转化 2. 重组菌的筛选 3. 挑取单克隆培养
第二次课程： 1. 质粒的提取 2. 质粒的浓度测定 3. 质粒的电泳 4. 质粒的酶切
基因工程实验报告重要数据
1. 挑单克隆后进行液体培养的培养物； 2. RFP重组菌液在IPTG/Amp LB平板上画图案； 3. 质粒转实验化中涂平板后的培养结果； 4. 琼糖脂凝胶电泳图谱； 5. DNA浓度测定表。
牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；
3-9
表1：酶切反应体系
酶切反应体系
组分
体积
RFP质粒 (~500 ng) 10 x buffer K EcoRI BamHI H2O
5 l 2 l 1.5 l 1.5 l 10 l
充分混匀，37℃1~2小时，加入2.5 l 10x Loading buffer 终止酶切，进行1 % Agarose电泳检测。
琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）。
浓度高凝胶的分辨力 空隙大小决定其分辨分子大小的能力。
空隙小，分辨率高： 小分子较易通过，而大分子难通过；
空隙大，分辨率低： 大小分子几乎以同等速率通过。
琼脂糖的浓度（%） 分离DNA的片断大小（bp）
0.3
50000—1000
特别注意: [1]吸取准确体积的酶；[2]甘油粘稠！
第二次课程： 1. 质粒的酶切 2. 质粒的提取 3.质粒的电泳 4.质粒的浓度测定
质粒的提取——碱裂解法
➢Solution I: 250 l，重悬菌体 ➢Solution II: 250 l，裂解(NaOH/SDS ) ➢Solution III：350 l，中和（醋酸钾） ➢Elution Buffe： 50 l，洗脱质粒
➢确定样品中核酸的纯度
纯 DNA: A260/A280 = 1.8 纯 RNA: A260/A280 = 2.0
（3）向冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液中加入1.5 μl 溴化乙锭(EB)试剂，(注意不要形成气泡)； 待胶凝固后，取出梳子，并放在电泳槽内，加 人电泳缓冲液至电泳槽中；准备上样电泳。
3-26
质粒的电泳上样顺序
Marker: 5 μl 质粒：400 ng 酶切产物： 20 μl
注意：质粒要加入2-3 l 10x Loading buffer， 混匀后再上样
第二次课程： 1. 质粒的酶切 2. 质粒的提取 3.质粒的电泳 4.质粒的浓度测定
第二次课程： 1. 质粒的酶切 2. 质粒的提取 3.质粒的电泳 4.质粒的浓度测定
DNA的限制性内切酶鉴定
质粒的限制性内切酶鉴定
EcoR I
质粒可能有3种构型及迁移率： 1.共价闭合环状质粒，最快； 2.线状质粒DNA，次之； 3.开环质粒DNA，最慢。
BamH I
酶贮存液
特别注意: [1]吸取准确体积的酶；[2]甘油粘稠！
缓冲液(Buffer) 是影响限制酶活性的重要因素。 商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。
缓冲液的化学组成
MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度；
Tris-HCl：
维持pH；
二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；
第二次课程： 1. 质粒的酶切 2. 质粒的提取 3.质粒的电泳 4.质粒的浓度测定
核酸分子具有强烈的紫外吸收
核酸在波长 260nm 处有强烈的吸收，是由碱基的共轭双 键所决定的。这一特性常用作核酸的定性和定量分析。
紫外吸收的应用
➢DNA或RNA的定量
A260 = 1.0 相当于 50μg/ml 双链DNA(dsDNA) 40μg/ml 单链DNA (ssDNA or RNA) 20μg/ml 寡核苷酸
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UVP全自动凝胶成像分析系统
3-22
标准分子量DNA marker
3-23
DNA琼脂糖凝胶电泳图谱（举例）
3-24
观看视频…
配置1%的agrose
（1）称取0.3g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入 30mL TAE，置微波炉或水浴加热至完全溶化， 取出摇匀；
（2）有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好 样品梳子；
观看视频…
第二次课程： 1. 质粒的酶切 2. 质粒的提取 3.质粒的电泳 4.质粒的浓度测定
3-15
琼脂糖凝胶电泳
琼脂粉(Agar)
1. 琼脂糖(Agarose)
是一种线性多糖聚合物，从海藻产物琼脂 中提取而来。
2. 琼脂糖凝胶
琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点 后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体 “胨”。
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凝胶染色
1. 染料
溴化乙锭。
Ethidium bromide （EB）
强致癌剂！！！ 佩戴手套，特别小心！
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2. 原理 EB是扁平分子，能插入DNA碱基之间，但 不与琼脂糖结合。 EB在300nm紫外光照射下能发红色荧光， 即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。 荧光强度与DNA含量及大小成正比。