生物工程07 酶与酶工程ppt

(2) 酶的大分子修饰
非共价修饰
使用聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在 酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保 护酶的活力。
共价修饰
用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通 过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。 例如：每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合， 酶活力达到原有酶活力的5.1倍
乳制品用酶 酿酒用酶
(美国）
饲料用酶 焙烤食品用酶
Cuitor(芬兰）
其它行业用酶 三大公司销售额占世界总
额的70%
国内酶制剂销售额比例
1965 无锡酶制剂厂 淀粉酶
1979 糖化酶 碱性蛋白酶 中性蛋白酶
1993 耐高温淀粉酶 1998 国外大公司纷入 1999年投产
洗涤剂用酶 淀粉、酒精用酶 其它
载体的作用： ▼保持酶的立体结构 ▼保护酶的活性中心 ▼保证酶的连续催化反应
酶固定化后的性质变化
酶固定化后，原有的某些性状会产生一定变化。
1 对底物的特异性。注意立体结构（分配效应，空间障 碍效应，扩散限制效应）对底物特异性的影响 2 酶反应最适PH值的改变。酶固定化后，酶蛋白质的电 子状态会发生改变，载体表面的电位要受影响。 3 动力学常数的改变。米氏常数和最大反应速度会改变 4 酶反应温度的改变 5 增加酶的稳定性。
O
H2N
CH C
OH
O
CH2 H2N
CH C
OH
CH2
CH2
CO
CO
COOH
OH
O OH
O
H2N
CH C
OH
H2N
CH C
OH
NH 2
CH2
CH2
CH2
OH
CH2
CH2
NH 2 OH
胰凝乳蛋白酶结构
3．调控部位 Regulatory site
酶分子中可与其他分子结合，引起酶分子空间构 象的变化，对酶起激活或抑制作用。
抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，底 物与抑制剂之间无竞争关系。
非竞争性抑制
(3)、反竞争性抑制作用
酶与底物结合后抑制剂才能和酶 结合
反竞争性抑制
酶抑制剂的应用
（1） 天然酶的自杀底物
Ackee(Blighia sapida) 植物——未成熟果实的假种皮中含有 一种有毒的降糖氨酸（即甲叉环丙基丙氨酸）
酶的研究历史
1878年,Kuhne提出Enzyme 1926年,美国生化学家Sumner第一次从刀豆分离到
脲酶结晶,提出酶是蛋白质.
1970 美国Smith 发现限制性内切酶（1979年诺 贝尔奖）
1969 日本固定化氨基酰化酶，第一次将固定化 酶成功地应用于工业生产。——酶工程诞生
1986 美国 核酶发现获得诺贝尔奖
酶分子修饰
通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从 而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分 子修饰。
酶分子的修饰方法
(1) 酶的金属离子置换修饰
把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶 的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置 换修饰。
α-淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中 的锌离子(Zn2+)
酶工程简介
酶工程是酶学和工程学相互渗透结合、发展形 成的一门新技术学科。它是从应用的目的出发研 究酶、应用酶的特异催化性能，并通过工程化将 相应原料转化成有用物质的技术。主要包括化学 酶工程和生物酶工程。
酶的定义
（一）、什么是酶？ 酶是活细胞产生的一类具有催化功能的生物分子。
绝大多数的酶都是蛋白质。
常见基团的化学修饰反应：色氨酸吲哚基
(4) 酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰)
利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其 空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法
a、胃蛋白酶原的激活
胃蛋白酶原
HCl pH1.5～2
胃蛋白酶（从N端失去44个氨基酸残基）
自身激活
b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活
脲酶
OC
+ H2O
2NH3 + CO2
NH 2 尿素
NH CH3
脲酶
OC
+ H2O
NH 2 甲基尿素
H
H
C
OH
H3C
COOH
C
COOH
H3C
OH
A BC
A BC
蔗糖
CH2OH
OH
H OH
OH H1
H
H
OH
棉子糖
1
CH2OH
H
OH
CH2OHO
H OH
H1
H
OH
O
H OH
OH
O CH2
HH OH
OH
H
蔗糖酶
酶工程的主要内容
化学酶工程：通过对酶的化学修饰或固定化处 理，改善酶的性质以提高酶的效率和减低成本， 甚至通过化学合成法制造人工酶。
生物酶工程：用基因重组技术生产酶以及对酶 基因进行修饰或设计新基因，从而生产性能稳 定，具有新的生物活性及催化效率更高的酶。
化学酶工程
化学修饰酶 固定化酶 人工模拟酶 抗体酶
(3) 酶分子的侧链基团修饰
采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧 链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能 的修饰方法。
常见基团的化学修饰反应：羧基 常见基团的化学修饰反应：氨基
常见基团的化学修饰反应：巯基 常见基团的化学修饰反应：咪唑基
常见基团的化学修饰反应：酚羟基 常见基团的化学修饰反应：胍基
酶和酶工程
酶和人类的关系
国际市场酶制剂销售额比例
2001年工业酶制剂的世界市场约为15亿美元
用于制药工业与精细化学工业约1.2亿~1.5亿美元
其它行业用酶 焙烤食品用酶
饲料用酶
洗涤剂用酶
酿酒用酶 乳制品用酶
纺织用酶
世界三大酶制剂公司
Novo Nordisk （丹麦）
洗涤剂用酶
纺织用酶 Genencor International
酶的分类
单体酶 肽链 寡聚酶
多酶体系
多酶复合体 多功能酶
•多功能酶（multifunctional enzyme）：一些多酶体系 在进化过程中由于基因的融合，形成由一条多肽链组 成却具有多种不同催化功能的酶。
与酶的高效率催化有关的因素
酶作用专一性的机制
诱导契合学说
锁－钥学说
中间产物学说
E + S ==== E-S P + E
物理吸附法固定化酶举例
活性炭
载体
多孔玻璃
氧化铝 碳酸钙凝胶 纤维素 麸素 硅胶
固定化酶
α －淀粉酶、β －淀粉酶 蔗糖转化酶、葡萄糖淀粉酶 核糖核酸酶、木瓜蛋白酶 脂肪酶、葡萄糖氧化酶 葡萄糖氧化酶
亮氨酸氨肽酶
胰蛋白酶、核糖核酸酶
Β－淀粉液化酶
磷酸化酶
格子型固定化酶及应用
制备的固定化酶 凝胶或膜
c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活
(5) 氨基酸置换修饰
Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活 性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对 蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底 物水解的活性。
酶分子的定点突变
1、基因序列分析 2、蛋白质结构分析 3、酶活性中心分析 4、引物设计进行基因定点突变 5、酶基因克隆表达 6、变异特性分析
酶的活性中心
酶 的 活 性 中 心
活性中心内必需基团 活性中心外必需基团
结合基团 催化基团
必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。
酶分子可根据其化学组成的不同，分为两类：
单纯酶
酶→
酶蛋白
结合酶（全酶）→
辅酶
辅助因子→ 辅基
金属离子
辅酶与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。 辅基与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。 大多数辅酶的前体主要是水溶性 B 族维生素。
聚丙烯酰胺凝胶
淀粉 琼脂
酶 α、β－淀粉酶 葡萄糖氧化酶 乳酸脱氢酶 胆碱酯酶 青霉素酰胺酶
微胶囊固定化酶及其应用
微胶囊法固定化酶
胶囊制法 表面聚合法 液中干燥法
相分离法
囊膜的素材 尼龙 聚合脲
聚苯乙烯
火棉胶 硝酸纤维素
应用的酶 乳糖酶 羧基脱氢酶 天门冬酰胺酶 过氧化氢酶 脂肪酶 脲酶 过氧化氢酶 天门冬酰胺酶
CH 3O
CH3O
H N.. O
H O
CH 3O
H
CH 3O
C
CH3O O
影响酶催化反应速度的因素
底物浓度——米氏方程 酶浓度 温度 pH值 抑制剂 激活剂
抑制剂对酶反应速度的影响
（1） 不可逆抑制 抑制剂与酶反应中心
的活性基团以共价形 式结合，引起酶的永 久性失活。 举例 有机磷化合物 羟基 酶
酶活性中心的必需基团
主要包括：亲核性基团：丝 氨酸的羟基，半胱氨酸的巯
基和组氨酸的咪唑基。
H2N H2N H2N
O
CH C
CH2
OH O
CH C
CH2 O
SH CH C
CH2
OH OH OH
N NH
OH
SH N
N H
酸碱性基团：
门冬氨酸和谷氨酸的羧基
赖氨酸的氨基酪氨酸的酚 羟基
组氨酸的咪唑基和半胱氨 酸的巯基等。
酶反应与非酶反应活化能的比较
自 由 能
底物
非酶促反应
ES*
ES 酶促反应 EP
产物 反应进程
酶的专一性 Specificity
又称为特异性，是指酶在催化生化反应时对底物的 选择性
酶的专一性包括 (1)结构专一性 绝对专一性 相对专一性 (2)立体异构专一性 光学异构专一性 几何异构专一性
NH 2
解毒 -- -- -- 解磷定 (PAM) 重金属离子及砷化合物 巯基酶
RO X
P + E OH R'O O 有机磷化合物 羟基酶
RO O E
P
+ HX
R'O O
磷酰化酶
酸
+ CHNOH N
CH3 解磷定
+
N
E OH
O OR' P
CHNO OR
CH3
有机磷化合物对羟基酶的抑制
SH Cl E + As
就可以生成不同的产物。
青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素
wenku.baidu.com
R1
H2N R2+ NH2
O
O
S N
O OH
1: D-(-)-PGA (R1 = H, R2 = NH2)
（2） 治疗用人工合成的酶自杀底物
治疗高血压；癫痫；抗青霉素的菌株；在肿瘤治疗上；治 疗震颠麻痹症；痛风症的自杀底物疗法。
激活剂对酶反应催化速度的影响
（一）、凡能够提高酶活性，加速酶促化学反 应的物质都称酶的激活剂（activator)。
（二）、激活剂的类型 1、无机离子 2、有机小分子 3、生物大分子
SH Cl
H C CHCl
巯基酶 路易士气
S E As
S
H C CHCl + 2HCl
失活的酶
酸
S
H
H2C SH
E As C CHCl + HC SH
S
H2C OH
失活的酶
BAL
SH
H2C
S
As
H C
CHCl
E + HC S
SH H2C OH
巯基酶 BAL与砷剂结合物
（2）、 可逆抑制
A、 竟争性抑制
1
OH
CH2OHO
H1
H
O
OH
OH
H OH
CH2OH H
H OH
CH2OH H
酶的结构及催化作用机制
一、 酶分子的结构特点
1．结合部位 Binding site
酶分子中与底物结合的 部位或区域
2．催化部位 catalytic site
酶分子中促使底物 发生化学变化的部 位称为催化部位。
通常将酶催化部位 称为酶的活性部位 或活性中心。
酶具有一般催化剂的特征：1.只能进行热力学上允许进行 的反应；2.可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变 反应的平衡点；3.通过降低活化能加快化学反应速度。
酶的催化高效性
通常要高出非生物催化剂催化活性的106~1013倍。
2H2O2
2H2O + O2 1mol过氧化氢酶 5×106 molH2O2 1mol离子铁 6×10-4molH2O2
天门冬酰胺酶
固定化酶的应用 1． 固定化酶在工农业生产上的应用
氨基酰化酶 乙酰 -DL — Ala
L — Ala +乙酸 乙酰 -D — Ala
A-LAla
A-D-
Ala 储
罐
固定化酶
柱子
消
泵
离心机
旋
反
应
器 反应产物
L-Ala A-D-Ala
晶体 L-Ala
2． 固定化酶在医药治疗上的应用 固定化青霉素酰化酶，只要改变pH值等条件，
定义 抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞 争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的 形成，使酶的活性降低。
竞争性抑制
1. 磺胺药对细菌FH2合成酶的抑制
Glu
+
H2N
COOH FH2合成酶 FH2 FH2还原酶
PABA
+ 二氢蝶呤
H2N
SO2NHR
氨甲蝶呤
磺胺药
FH4
3. 抗代谢物的抗癌作用
(2) 非竟争性抑制
化学酶工程
化学修饰酶 固定化酶 人工模拟酶 抗体酶
酶和细胞固定化
固定化酶的定义：
固定化酶是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说， 是指经物理或化学方法处理，使之与不溶性载体结合形 成的一种不再溶解的酶。
酶固定化方法
固定化酶的作用模型及其反应机理
以羧甲基纤维素固定 葡萄糖淀粉酶水解淀 粉生产葡萄糖为例说 明。
反应过程中能量的变化
能 量
一般催化剂催 化反应的活化能
底物
非催化反应活化能
酶促反应 活化能
反应总能量改变
产物 反应过程
（自由能）
3、 多功能催化作用
酶的活性中心部位，一般含有多个催化基团，他们对底物 价键的形变和极化及调整底物基团的位置等起协同作用
CH3O
CH3O CH 3O
NO
.. H
O OH