本科论文开题报告(新城疫)

本科毕业论文开题报告

设计题

鸡新城疫病毒分离与鉴定

目

导师推荐题目类型 C 指导老师钱琨

题目来

源

虞思聪学号122203221 专业动物医学

学生姓

名

开题理由：了解学习新城疫病毒的鉴定方法。

项目背景：我国于20世纪80年代对新城疫实行了全面免疫的策略，对我国新城疫的防控起到了关键作用，使得流行得到一定的控制，但随后我国新城疫呈现出新的流行病学特点，如：非典型性新城疫越来越普遍、免疫失败现象日益严重、感染宿主范围扩大、多种基因型并存等。尤其需要指出的是，我国主要流行的新城疫病毒基因型也在不断进化中，如我国最早分离到的F48株属于经典的基因IX型，在1970年代后期和80年代初期我国西部地区曾出现过基因VIII型毒株，20世纪80年代和20世纪90年代初期分离到的毒株则以基因VI型为主，20世纪90年代中期我国首次出现了基因VII型新城疫病毒，至今该基因型毒株仍然是我国禽群中流行的优势基因型，而近年来在部分地区还出现了基因XII型。

研究方案方法：

一．材料ND标准阳性血清，禽流感H9H5标准阳性血清，减蛋综合征（EDS-76）标准阳性血清。10日龄SPF鸡胚，1日龄SPF鸡胚，6周龄SPF鸡。疑似新城疫病鸡的脑。肝脏。脾脏等。

二．方法：病毒分离接种鸡胚。鸡胚气室向上置于蛋架上，在所标记接种部位用经火焰的钢锥钻一个小孔，注意要恰好使蛋壳打通而又不伤及壳膜。再在非气室部位的蛋壳上无血管的标记处用经火焰的钢锥钻一个小孔，以打开蛋壳而又不伤及壳膜为宜，然后用1ml注射器抽取接种物，与蛋壳成30°角斜刺入小孔3-5mm，注入接种物。一般接种量为0.1-0.2ml。注射后用融化的石蜡或消毒胶布封闭注射小孔。气室朝上置于37℃温箱中孵育。

三．检查：接种后每天检查3-4次。接种后24h内死亡的鸡胚多数是由于鸡胚受损或污染细菌引起的，一般弃去。但有些病原微生物（如高致病力禽流感病毒）也可能会在短时间内引起鸡胚死亡，只是应对可疑尿囊液做进一步鉴定。

四．鉴定：微量α法血凝抑制试验：取洁净的96孔V形微量滴定板用微量移液器从滴1孔至第12孔各加生理盐水50µL。用微量移液器吸取尿囊液50µL，加入第1孔并吸吹3-5次，使其与生理盐水充分混匀后依次倍比稀释至第11孔，弃去50µL，第12孔不加病毒液作为对照，做相同的2排。后用液器向第一排的1-12孔各加50µL的生理盐水。第二排没空各加一定稀释度的新城疫阳性血清50µL，后在第一排和第二排每孔各加１％的鸡红细胞悬液50µL，将滴定板放在微量震荡混匀器上（或用手工旋转）混匀，于20-30℃或室温静置15-20min，待对照孔完全沉淀后判定并记录结果。血凝实验第一排和α法血凝抑制试验。两排孔的血凝价相差2个滴度以上判为阳性，即判定待检病毒为新城疫病毒；如两排孔的血凝价相等或差异小于2个滴度者为非特异性凝集，或为其他病毒引起，应判为阴性。

HA和HI试验：1．红细胞凝集试验采用50孔板或试管法，若采用96孔微量板法进行，

用生理盐水将待检抗原按术式稀释成不同倍数，加入1%鸡红细胞悬液。将50孔板或试管前后左右摇匀；将96孔微量板在振荡器上摇匀，置于20～30℃，20～40分钟后（微量板法时间短, 15～30分钟）判定结果，使50%红细胞凝集的最高稀释度，作为判定终点。2.血凝抑制试验（HI）采用50孔板法或试管法，用生理盐水将被检血清做2倍系列稀释，加入含4HA50的抗原液，并设生理盐水和病毒对照，充分振荡后，在37℃作用15分钟；再加入1%鸡红细胞悬液，置20～30℃，20～40分钟后判定结果。使50%红细胞凝集抑制的最高稀释度，作为判定终点。

鉴定结果表明所分离的分离物中有12个分离株的尿囊液可凝集鸡红细胞，HA凝集效价在2^7---2^9,其中10株可被鸡新城疫标准阳性血清抑制，不能被AI阳性血清和EDS-76阳性血清抑制，初步判定为NDV。

五．毒力测定实验。1. MDT的测定按照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准(2001 年版)规

定的标准方法执行。用灭菌PBS 缓冲液将新收获的各毒株尿囊液作10 倍递增稀释，取10-6、10-7、10-8三个稀释倍数，各接种 5 枚10 日龄鸡胚，每胚尿囊腔内注射0.1mL。接种后每天早晚各照蛋一次，连续观察7d，记录每一鸡胚的死亡时间。鸡胚全部死亡的最高稀释倍数为最小致死量（MLD），各毒株最小致死量致死鸡胚死亡时间的总和除以死亡鸡胚总数，所得商即为该毒株的MDT。

2.ICPI（脑内致病指数）的测定参照新城疫诊断技术国家标准，将各含毒尿囊液用灭菌PBS 缓冲液作10 倍稀释，分别脑内接种1 日龄雏鸡10只，0.05mL/只，另取2 只接种生理盐水作对照，接种后观察 2 次/d，记录雏鸡的生长情况，正常记0 分，发病记1 分，死亡记2 分，连续观察8d。累记总分除以正常、发病和死亡鸡的累计总数所得的商即为ICPI。

3. IVP（静I 脉内接种致病指数）的测定参照新城疫诊断技术国家标准，将各含毒尿囊液用灭菌PBS 缓冲液作10 倍稀释，分别静脉接种 6 周龄敏感鸡10 只，0.1mL/只，另取2 只接种生理盐水作对照，接种后观察2 次/d，记录接种鸡的生长情况,正常记0 分，发病记1 分，麻痹记 2 分，死亡记3 分，连续观察10d。累记总分除以正常、发病、麻痹和死亡鸡的累计总数所得的商即为IVPI。

项目安排：2015.9--2015.10 材料准备2015.10-2016.1 各类试验2016.5-2016.6 准备结题