微生物实验十七、酵母RNA的提取及组份鉴定

一、实验目的

1. 了解并掌握稀碱法提取核酸的原理和方法。

2. 学习使用血球记数板测定微生物数量的方法。

3. 了解核酸的组分并掌握其鉴定方法。

二、实验原理

核酸是一类不稳定的生物大分子，在制备过程中很容易发生降解。因此，要使制得的核酸尽可能保持其在生物体内的天然状态，制备核酸必须采用温和的条件。酵母核酸中RNA含量较多，RNA达

2.67-

10.0%,而DNA含量仅为

0.03-

0.516%,酵母核酸的提取方法较多,工业上一般选用成本较低、适宜于大规模操作的稀碱法和浓盐法。稀碱法是用1% NaOH溶液，将细胞壁溶解，用酸

中和,升高温度使蛋白质变性,将蛋白质与核酸分离,然后除去菌体,将pH 调至RNA 的等电点（pH

2.5）,使核酸沉淀出来。稀碱法的优点是抽提时间短,但核酸在此条件下不稳定,容易分解。

血球计数板法主要计数酵母、原生动物等个体较大的微生物,是计数一定容积中的细胞总数的常用方法。其型号分为X

B.K.

25.和X

B.K.

16. 两种,前者是一个大方格分成25 个中方格,而每个中方格又分成16 个小方格；后者为一个大方格分成 1 6个中方格,而每个中方格又分成25个小方格。但无

论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为1mm,则每一个大方格的面积为1mm2,盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为

0.1mm，所以计数室的容积为

0.1mm3 （万分之一毫升）。

核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光。RNA的紫外吸收高峰在OD260nm波长处。一般在OD260nm波长下，每毫升含1⑷RNA 溶液的吸光值为

0.022。故测定未知浓度RNA溶液OD260nm波长的吸光值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便，迅速。

核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸等各组分，加入硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。磷酸与定磷试剂作用可以生成蓝色的钼蓝。核糖与地衣酚试剂反应呈鲜绿色。脱氧核糖与二苯胺试剂反应生成蓝色化合物，而核糖无此反应。嘌呤碱与硝酸银反应能产生白色的嘌呤银化合物沉淀。

三、试剂和仪器设备

1. 材料与试剂

酵母粉；

0.04mol/LNaOH;酸性乙醇：将0.3mL浓盐酸加入到30mL乙醇中；95%乙醇；

1.5mol/L硫酸；浓氨水；

0.1mol/L硝酸银。

定磷试剂：17%硫酸：

将17mL浓硫酸（比重1084）缓缓倾入83mL水中；

2.5％鉬酸铵：

2.5g鉬酸铵溶于100mL水中；10%抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于

100mL水，棕色并保存溶液；临用时将三种溶液和水按下列比例混合：

17%硫酸：

2.5%鉬酸铵：10%抗坏血酸：

水=1: 1: 1: 2 (V/V)。

2. 仪器

250mL三角瓶；离心机；温度计；研钵；分析天平；紫外分光光度计；恒温水浴；冰浴。

四、操作步骤

1. 稀碱法制备核酸

(1)将10g干酵母悬浮于50mL

0.04mol/LNaOH溶液中，并在研钵中研磨成浆状。

(2)将酵母浆转入100mL三角瓶中，置沸水浴中加热30mi n。后冷却

3000r/min 离心15min。

(3)上清液倒入20mL的酸性乙醇中，边搅拌边倾入。

(4)沉淀完全后，3000r/min离心10min。弃上清液。

(5)用10mL95%乙醇洗涤沉淀，3000r/min离心5min。重复洗涤一次(

将沉淀转入布氏漏斗中抽滤。得到湿RNA粗品。

(6)用电子天平称提取的湿RNA粗品的重量。

2. R NA组份鉴定

取2g 提取的核酸，加

1.5M硫酸10mL沸水浴加热10分钟制成水解液，然后进行组份鉴定。

（ 1 ）嘌呤碱：

取水解液1mL加入过量浓氨水。然后加入1mL

0.1M 硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱银化合物沉淀。

（2）磷酸：

取水解液1mL,加定磷试剂1mL。在水浴中加热观察溶液是否变成蓝色。

（3）核糖：

取水解液1mL，三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液

0.2mL。放沸水

性条件下合二苯胺在沸水浴中共热后，产生蓝色。这是因为DNA嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成⑴羟基-6-酮基戊醛，再与二苯胺作用产生蓝色物质。

DNA+少量浓硫酸或冰乙酸+二苯胺-蓝色物质。

DN

A、蛋白质和粘多糖等物质对测定有干扰作用。

五、实验数据及其处理

（1）记录稀碱法提取RNA质量，计算提取率

（2）记录每克活性干酵母所含酵母数。

六、思考题

1. 为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？

2. 如何从酵母中提取到较纯的RNA？