基因工程的主要技术与原理-核苷酸序列分析

(三) 化学降解法的应用
Maxam-Gilbert化学降解法的测序长度大约为250个
碱基，适合G+C含量较高及较短的寡核苷酸片段的 测序； 从DNA两端分别测定同一条DNA核苷酸序列，相互 参照测定结果，可以得到准确的核苷酸序列；
Maxam-Gilbert化学降解法不需要进行酶催化反应，
起始位点相同的、不同长度的、以不同碱基结
尾的DNA片段群； 3. 分离：通过凝胶电泳分离片段群；
4. 推导：再经放射线自显影，确定各片段末端碱基， 从而得出目的DNA的碱基序列。
凝胶电泳分离，放射线自显影分析
G A+G C+T C 3′
5′ 5′ C T T T T T T G G G C T T A G C 3′
基因分析工具
NCBI:（美国国家生物技术信息中心）

EMBL:（欧洲生物信息学研究所）

Sanger中心:（基因组测序中心）

ExPASy:（瑞士生物信息学研究所蛋白质分析系统）
H
ddNTP
ddATP
ddCTP
通过聚丙烯酰胺凝胶电 泳能分辨出小至一个碱基 长度差异的DNA片段,从 而将混合产物中不同长度 DNA片段分离开。
再通过放射自显影曝光, 根据片段尾部的双脱氧核 苷酸读出该DNA的碱基排列 顺序。
(二) 序列分析的基本步骤
模板变性(dnature template)：将待测DNA模板 与引物混合，通过加热时模板变性； 退火(annealing)：将变性的模板与引物混合物 缓慢降温，使引物与模板结合； 标记(labeling)：利用放射性同位素标记核苷酸 或引物； 延伸(extension)和终止(termination)：反应体 系中新生核苷酸的合成和随机终止过程； 电泳分析和数据读取：聚丙烯酰胺凝胶电泳，放 射自显影，读取DNA的碱基排列顺序。
生物技术专业核心课程
基因工程
基因功能的研究是生命科学中的主要课题； 其首要条件是获知目的基因的核苷酸排列顺
序，即基因测序。
基因测序是基因 操作中最基本的技 术之一。
第四节 DNA核苷酸序列分析 (Nucleotide sequence analysis)
基因测序方法
Maxam-Gilbert 化学降解法
三、化学合成DNA（寡核苷酸）的应用
作为合成基因的元件
作为测序的引物 作为核酸分析杂交的探针 用于基因定点诱变研究 作为PCR反应的引物 作为重组DNA连接等的构件
本节要点
1.Maxam-Gilbert化学降解法测序的基本原理 2.Sanger双脱氧链终止法测序的基本原理 3.DNA序列自动化分析的基本原理 4.何为引物步移？
测序仪ABI Prism310 Genetic analyzer实际测得的 一段DNA序列结果。
红色代表 T ；绿色代表 A ；兰色代表 C ；黑色代表 G 。
ABI Prism DNA Sequencer 3130
ABI Prism DNA Sequencer 3730
使用毛细管凝胶电泳分离链终止反应产物， 可大大增加测序的通量，根据毛细管的数量的 不同，一台仪器可同时完成96个样品或更多样 品的分析。
因此，不会产生由于酶催化反应而带来的误差；
Maxam-Gilbert化学降解法的缺陷：
操作繁琐； 化学试剂毒性较大； 放射性同位素标记效率偏低，放射自显影 曝光时间长； 人工读取数据费时费力；
二、双脱氧链终止法
1977年，英国的F.Sanger充分利用DNA复 制的生物学特性，设计了一种通过DNA复制
反应体系中除含有四种脱氧核苷酸(dATP、 dCTP、dGTP和dTTP)外，加入了一种双脱氧
核苷酸(*ddATP或*ddCTP或*ddGTP或*ddTTP)。
在DNA合成过程中，标记的*ddNTP将与相应的 dNTP竞争掺入到新合成的DNA互补链中。
如果是dNTP掺入其中，DNA互补链则将继续延 伸下去；如果是*ddNTP掺入其中，DNA互补链的 合成则到此终止.而双脱氧核苷酸的掺入是随机 的，故各个新生DNA片段的长度互不相同。
1.基因序列的信息分析
寻找开放阅读框、预测外显子和内含子、分析调控
序列、在公共基因数据库中寻找相似的序列以及相似
性比较等；
2.RNA结构分析
预测RNA二级结构，计算折叠数等；
3.蛋白质序列的信息分析
预测蛋白质的二级结构、三级结构及功能等。
基因数据库及分析工具
基因数据库
GenBank（美国）； EMBL（欧洲）； DDBJ（日本）；
全自动测序具有较高准确性和安全性、操作 相对简单、可供大规模操作，而且，一次测序 反应提供的数据也增大。 一般同位素标记的测序只能读出200-300个核 苷酸序列；而荧光标记测序则可读出500-800个 核苷酸序列。
问题：
利用双脱氧链终止法测定DNA序列时，需要一段 已知序列的寡核苷酸引物。因此，对于一段未知 序列的DNA片段，如何选择测序引物？
三、DNA序列分析的自动化
该测序方法是1987年，由美国Perkin-Elmer公司 应用生物系统部门(Applied Biosystem)的研究人
员首先设计开发出来的，并设立了相关的测序程序
和试剂盒以及ABI系列自动测序仪； 其核心技术在于使用荧光染料标记代替同位素 标记；
基本原理
基于Sanger双脱氧链终止法的原理，只不过不 用同位素标记ddNTP，而是用四种不同的荧光染
一次测序只能读出800个核苷酸，对于较长的DNA 片段，如何测序？
1.通用引物指导未知序列的测定
对于一段未知序列的DNA
HindIII SphI PstI 5746 XbaI Ba可以将其装载在载体
上，这样，待测DNA片段的 两端就相当于添加了已知序 列，因此，可根据载体序列 设计通用引物测定待测DNA
http://www.expasy.ch
GmMYBZ2
ORF： 744bp 247aa MYB-DNA binding 1: 13-63aa
MYB-DNA binding 2:
65-114aa
具有转录抑制作用 的保守基序：
pdLNLD/ELXiG/S
GmMYBZ2空间结构预测 （CHPmodels-2.0服务器 ）
GmMYBZ2 蛋白的三维空间结构预测 红色：a-螺旋；蓝色：b-折叠；白色：无规卷曲
第五节 基因的化学合成 (Chemical Synthesis of the Gene )
一、化学合成DNA的发展 二、化学合成寡核苷酸片段的主要方法 磷酸二酯法 磷酸三酯法 亚磷酸三酯法 固相合成法 自动化法
哌啶甲酸：
肼+NaCl：
G和A
C
肼：
T和C
5′ 3′
3′ 5′
待测DNA 放射性标记5′末端
R
限制性酶切 变性
(放射性自显影只显示标记的单链)
G
A+G
C
C+T 特异性切割
G
A+G
C+T
C
凝胶电泳分离，
放射自显影确
定末端碱基。
(二)基本步骤
1. 标记：将待测DNA片段的5‘端磷酸基作放射性标记； 2. 裂解：修饰和裂解特定碱基，随机产生一端被标记的、
按相差1个核苷酸大小的DNA片段长度顺序向下泳
动，当到达检测器时，激光探测仪发出激光，激
发DNA片段发出荧光,荧光信号传输至计算机便可
自动排列出DNA的核苷酸序列。
链终止反应
电泳
ddA ddG ddC ddA ddC ddC ddG ddT ddG ddA 荧光信号
激光激发
AGTGCC ACGT
序列结果：
链终止反应的测序结果
电 泳 方 向
链终止反应的测序结果
5′-CCCGTAGTAGTCGTGCCCGCTACCGCTAGGACCCAGAAAGCCA -3′
链终止法和化学修饰法的缺点
需要放射性同位素作为标记物 对序列胶的要求较高 操作步骤繁琐、效率低、速度慢
判读时即花时间又乏味
双脱氧链终止法(Sanger 酶解法)
一、Maxam-Gilbert 化学降解法
1977年，A. M. Maxam和W. Gilbert首先
建立了 DNA片段序列的测定方法，由于该方
法是用特定化学试剂修饰不同碱基，并在相
应碱基处切断DNA片段而进行系列分析的,故
称之为Maxam-Gilbert化学降解法。
3′-G…CATNNNNNNNNNNNNNNN-5′ 5′-C…GTA-3′
延伸终止反应
待测模板 引物
ddATP
5′-C…GTANNNA-3′ 5′-C…GTANNNANNNNNA-3′ 5′-C…GTANNNNNNNNNNNNA-3′ 5′-C…GTANNNNNNNNNNNNNNA-3′
ddTTP
料分别标ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP。
这四种荧光染料在激光激发下发出不同波长的 荧光，因而每一种荧光代表一种碱基。
延伸中的DNA互补链分别终止于不同荧光标记的
ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP，四种连终止反应
可在一个试管中进行，并在同一条泳道中检测。 反应产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳中
(一)基本原理
将一个DNA片段的5‘端磷酸基作放射性标记； 分别采用不同的化学试剂修饰和裂解特定碱
基，从而产生一系列长度不一而5‘端被标记的
DNA片段；
通过凝胶电泳分离这些以特定碱基结尾的片 段群，再经放射自显影，就可确定各片段末端 碱基，从而得出目的DNA的碱基序列。
核心原理： 利用特定的化学试剂对不同碱基进行特异 性切割。 硫酸二甲酯： G
5′-C…GTAT-3′ 5′-C…GTANNNNNT-3′ 5′-C…GTANNNNNNT-3′ 5′-C…GTANNNNNNNT-3′
ddGTP
5′-C…GTANG-3′ 5′-C…GTANNNNNNNNNNG-3′ 5′-C…GTANNNNNNNNNNNG-3′
ddCTP
5′-C…GTANNC-3′ 5′-C…GTANNNNC-3′ 5′-C…GTANNNNNNNC-3′ 5′-C…GTANNNNNNNNNNNNNC-3′
来识别4种碱基的方法，即双脱氧链终止测
序方法(dideoxy chain termination)或称 Sanger酶学法。
5´-磷酸核苷酸的基本结构
(一)基本原理
在DNA聚合酶的作用下，双脱氧核苷酸分子
可以象正常核苷酸一样参与DNA合成； 但是，由于它自身3′位置-OH的缺失，至使下 位核苷酸的5′磷酸基无法与之结合，从而导致反 应终止，并产生长度不一的DNA片段。 通过凝胶电泳分离，放射自显影确定DNA片段
GN 5800bp
SacI EcoRI
核苷酸序列。
2.引物步移测定大片段DNA核苷酸序列
在待测DNA片段中，如果知道部分核苷酸
序列，就可以根据该已知序列设计引物来测
定其相邻部位的序列，并可依次类推，直至
测出全部待测序列，这种方法称为引物步移
(Primer Walking)。
四、DNA序列的信息分析
末端的碱基，进而推断DNA的核苷酸序列。
5´
3´
5´ 3´
5´
3´
正常的DNA合成反应
ddNTP 掺入到DNA合成反应后导致反应终止
基于双脱氧核苷酸的这种特性，Sanger于 1977年建立了以双脱氧链终止反应为基础来 测定DNA序列的方法； 该方法以待测DNA为模板，在DNA聚合酶的
催化作用下合成新的DNA链；