细菌拮抗作用的筛选 - 副本

细菌对几种病害的拮抗作用植物病害拮抗细菌的筛选和应用是植物病害防治的研究热点。拮抗细菌及其代谢产物的开发利用, 以及通过基因工程改造产生新型、高效、稳定、适生性强的拮抗细菌是今后生防菌发展的趋势。拮抗细菌作为生物防治措施的成功例子已经存在。

植物内生菌是一个多样性十分丰富的微生物类群,已受到各国生物学家的高度关注。大量研究结果表明:植物内生菌在体内占据有利于生防的生态位,具有生物防治,植物促长,增强宿主抗逆境、抗病虫害、抗菌、抗病毒和抗肿瘤活性等优点。近年来,对植物内生菌的生态和生理作用及其作为潜在的生防资源和外源基因载体的研究,已逐渐成为国内外研究的热点。关于内生细菌对植物病原菌的拮抗作用,前人研究已证明,植物内生细菌中存在有大量的对植物病原菌具有拮抗作用的菌株,不同植物含有对病原菌具有拮抗作用的内生细菌的种类有所不同。本实验研究了拮抗细菌对几种病害的拮抗作用，进而在病害的生物控制病害方面提供了一个发展趋势。

1 材料及方法

1．1 材料

1．1．1 培养基PDA、NA培养基、金氏培养液

1．1．2 供试菌从植物组织中分离的内生菌

1．1．3 病害种类马铃薯炭疽病菌、枯萎病菌、茎点霉

1．2 方法

1.2.1 内生菌的分离纯化

将植物组织用自来水清洗表面后,晾干称重后用10%的次氯酸钠溶液消毒中10 min, 之后浸入0.1%的升汞中2min，最后用无菌水冲洗3次,用滤纸吸干, 放入研钵中加入质量分数为0.85%Nacl研磨,梯度稀释后涂布于NA培养基, 28℃培养箱中倒置培养3−7 d。同时以最后一次洗涤的水作为对照。根据平板上长出菌落的形态、颜色、大小等挑取不同单菌落, 反复划线纯化后接斜面保藏。

1．2．2 拮抗菌的筛选

1．2．2．1 采用平板对峙法

采用平板对峙法测定抑菌效果，将纯化好并活化的细菌接到NA培养基中制成平板, 28℃恒温培养24h，用直径5 mm的打孔器取致病菌菌块于PDA 平板中央,在其周围4个等距离位置上分别接上4种不同的内生细菌,每处理做3次重复，进行初筛选，培养3～5 d后,观察不同内生细菌是否对致病菌有抑制生长的作用及抑菌圈的大小(取3次重复的平均值)。对抑菌效果好的细菌再进行筛选， 28 ℃下恒温培养至对照长满后，测致病菌菌落的长和宽, 计算拮抗细菌对致病菌的抑菌力。抑菌力= (D-B)/D（100 %)（D : CK 致病菌菌落直径；B : 处理致病菌菌落宽度），每处理重复3 次, 只接致病菌菌饼为对照( CK) 。

1．2．2.2 拮抗细菌对致病菌孢子萌发的影响

在金氏培养液中培养36 h ( 30 ℃ ) 的拮抗细菌用细菌过滤器过滤, 滤液分别稀释0、10、100 倍, 每浓度溶液中加入病菌孢子, 配成孢子悬浮液, 以金氏培养液配成的孢子悬浮液为对照。采用悬滴法

25 ℃条件下培养8h、12h、16h、24h, 分别镜检致病菌孢子萌发率。每处理测300 个孢子, 以芽管长度超过孢子直径一半为萌发。

展望

对拮抗细菌的代谢产物进行改造, 如多肽类抗生素可以通过基因定点突变技术对分子进行修饰, 以提高其活性。遗传工程拮抗细菌是新型、高效的一代生防菌。要使拮抗细菌达到理想的效果, 将生物工程技术与生物防治技术相结合, 即遗传工程拮抗细菌和抗菌物质的改造以及把拮抗细菌的抑菌基因转入植株基因组中获得高抗或免疫品种三者结合起来, 提高拮抗细菌的生防水平, 将是拮抗细菌的研究目标。