色谱基础知识简介

比值恒定不变，则该峰为纯组分色谱峰。 2.准确度 分析方法的准确度（accuracy）表示测得值与真值或 认可的参考值之间的一致程度。此外，真实性 （trueness）表示一组测量值的平均值与真实值间的差 异，偏差（bias）表示多组测量值的平均值与真实值间 的差异,偏差是由系统误差引起的。通常用回收率实验 来验证准确度。方法回收率实验应包括整个实验过程， 实际上是以相同的方法配置分析对照品系列和测试样
1.产生机理 质谱法是将样品置于高真空中（＜10-3 Pa），
并受到高速电子流或强电场等作用，失去外层
电子而生成分子离子，或化学键断裂生成各种
碎片离子，然后将分子离子和碎片离子引入到
一个强的正电场中，使之加速，加速电位通常
用到6~8kV，此时可认为各种带正电荷的离子都
4.检测限和定量限 在样品中能检测出的被测组分的最低浓度（量）称为检 测限（limit of detection,LOD），对其测定的准确度和 精密度没有确定的要求。 能以适当准确度和精密度定量测定的样品中组分的最低 浓度（量）称为定量限（limit of quantitation,LOQ）。 这对低含量的组分的测定如杂质含量的定量测定和体内 代谢物的测定十分重要。在定量分析中，定量限比检测 限更重要。
品，以对照品结果绘制标准（工作）曲线，在以此曲线 确定样品的浓度。再在已知浓度的样品中加入一定量的 对照品，检测其含量。测得值与已知值之差除以加入值 再乘以%即为回收率。回收率一般在100±5%。 3.精密度 分析方法的精密度（precision）表示在规定条件下对同 一均匀样品多次测得的一组测得值之间的一致程度。精 密度的表示方法有标准偏差、方差，更多的是相对标准
（intra-day）、不同实验批（intra-assay）、不同分析
者、不同仪器间的一致程度。再现性是不同实验室间的
一致程度。 在HPLC分析中，如果只用对照品（或样品）溶液重复 进样测定精密度，这只表示色谱系统的精密度。而方法 的精密度的验证应该对均一的真实（QC）样品进行包 括样品处理在内的全过程操作,用接近最低、中间和最 高浓度的三个样品浓度进行随机分析。日间精密度还应 该连续测定8天，每个样品每天至少测定2次。
二、定性分析方法 定性分析及鉴别试验可以分为色谱鉴别法和非色谱鉴别 法，后者又可分为化学鉴别法和光谱鉴别法。 1.色谱鉴别法
色谱鉴别法是利用色谱定性参数保留时间（或保留体积） 对组分进行定性分析，其原理是同一物质在相同色谱条 件下保留时间相同。此法只适用于已知范围的未知物， 如合成药物的前体或药物的可能代谢产物等。
1.7.2 计算方法--峰处理参数
★峰处理参数(半峰宽, 斜率, 漂移, 变参时间等) 半峰宽：设为最窄峰的半高宽，单位：秒 控制斜率测试时间（对于这些现场人员不能理解的专业俗 语可以不提或使用通俗易懂的语言进行描述）：10×半峰宽 推荐值：填充柱5 s 毛细柱 2~3 s 斜率：10倍半峰宽内所有信号的总和 判断峰起点 滤除低平噪声（如蛇行等） 斜率值确定：一般采用斜率测试值，也可根据实际需要手 动输入。 漂移：判断相邻峰的积分方式 设定值为0时，工作站将自动判断 如漂移值与基线至峰谷连线较接近时，积分可能不稳 定，导致面 积值变化较大，需加以注意。
2.1高效液相色谱法
• 一、概述 气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物， 而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、 极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。所以，HPLC的应用范围 已经远远超过气相色谱。 通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离 子色谱法和凝胶色谱法四大类。其实，有些液相色谱方法并不能简单 地归于这四类
质分析。对于任何方法都必须进行验证和评价。
一、 HPLC分析方法的参数及验证
1.专一性 专一性（specificity）又称为特效性，是指在可能存在诸 多干扰组分时方法明确确定被分析组分的能力，分析含 有和不含有干扰组分的样品，比较分析结果，其差异即 是方法偏差（bias）。如果结果没有差异，则说明方法 具有专一性。 HPLC方法的专一性可以通过检查色谱峰 纯度来验证。采用多波长紫外检测器时，同时在两个波 长下检测色谱峰，如果测得该峰在两波长之处的吸收之
量分析。但要求进样量必须准确，否则定量误差大。 2.内标法 选择适宜的物质作内标物，以待测组分和内标物的 峰高比或峰面积比求算试样含量的方法称为内标法。内 标法的关键是选择合适的内标物。内标物应该是样品中 不含有的物质，纯度要高，与待测组分有相似的理化性 质，保留时间与待测组分相近，与样品中各组分能完全 分离且不与样品反应。 也分为工作曲线法、内标一点 法（内标对比法）。
1.5气相色谱仪的流动相----载气
• • • •
氦气（纯度99.99%以上） 氮ຫໍສະໝຸດ Baidu（纯度99.99%以上） 氩气（纯度99.99%以上）特殊分析使用 氢气（纯度99.99%以上）注意安全
1.6色谱术语
• 1）基线：在实验条件下，色谱柱后仅有纯流动相进入检 测器时的流出曲线称为基线。基线在稳定的条件下应是一 条水平的直线。它的平直与否可反应出实验条件的稳定情 况。 • 2）峰高（h）和峰面积 ：色谱峰顶点与基线的距离叫峰 高。色谱峰与峰底基线所围成区域的面积叫峰面积。 • 3）保留值 • a. 死时间(t0) ：不与固定相作用的物质从进样到出现峰 极大值时的时间，它与色谱柱的空隙体积成正比。由于该 物质不与固定相作用，因此，其流速与流动相的流速相近。 据 t0 可求出流动相平均流速
2.2高效液相色谱仪
2.3液相色谱简易流程图
色谱柱
进样器 输液泵 溶剂
检测器
柱温箱 废液
数据处理
2.4基本分析方法
高效液相色谱法在医药领域中的应用非常广泛，它 能用于化学合成药物的含量测定和杂质限量分析，用于 中草药和中成药的定性鉴别和有效成分或指标成分的测 定，也用于制剂分析，还用于药物代谢和动力学研究。 此外，HPLC还广泛用于天然药物有效成份的分离制备 和纯化。这些方法主要分为：定性分析、定量分析、杂
3.光谱鉴别法 3.1. 两谱联用法：当相邻组分的分离度足够大时，以制 备HPLC获得纯组分，而后用红外光谱、质谱或核磁共 振等分析手段进行定性鉴别。 3.2. 两谱联用仪：将高效液相色谱仪与光谱仪用界面连 成一个整体仪器，实现在线检测，称为两谱联用仪。两
谱联用仪能同时给出样品的色谱图和每个组分的光谱图， 获得定性、定量分析信息。因此，高效液相色谱-光谱 联用仪是当今最重要的分析鉴别方法。
偏差（RSD）。 精密度可分为重复性（repeatability）、中间精密度 (intermediate precision)和再现性（reproducibility）， 后两者统称为再现性。重复性表示在相同条件下，短时 间间隔内的一致程度，如日内精密度（intra-day precision）和批内精密度(intra-assay 或intra-run precision)；中间精密度表示同一实验室内不同日期
1.7.1 数据可靠性判断
★良好的峰面积重现性，一般CV%在0.5~3% （变异系
数（什么叫变异系数）：标准差与均值的比率)
★工作曲线具有良好的线性 相关性要在三个9以上。 ★峰形正常，避免拖尾峰和前沿峰 (柱选择恰当、衬管无污染、温度及流量设定) ★色谱峰分离良好(分离度(什么叫分离度)>1.5)
3.1质谱法的基本原理
一、概述
• 质谱分析法是在高真空系统中测定样品的分子离子及碎片离子质量， 以确定样品相对分子质量及分子结构的方法。
• 化合物分子受到电子流冲击后，形成的带正电荷分子离子及碎片离
子，按照其质量 m 和电荷 z 的比值 m/z （质荷比）大小依次排列而被 记录下来的图谱，称为质谱。
1.2气相色谱原理
GC主要是利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实 现混合物的分离。 待分析样品在汽化室汽化后被惰性气体（即载气，也叫 流动相）带入色谱柱，柱内含有液体或固体流动相，由于样 品中各组分的沸点、极性或吸附性能不同，每种组分都倾向 于在流动相和固定相之间形成分配或吸附平衡。但由于载气 是流动的，这种平衡实际上很难建立起来。也正是由于载气 的流动，使样品组分在运动中进行反复多次的分配或吸附/ 解吸附，结果是在载气中浓度大的组分先流出色谱柱，而在 固定相中分配浓度大的组分后流出。当组分流出色谱柱后， 立即进入检测器。检测器能够将样品组分的与否转变为电信 号，而电信号的大小与被测组分的量或浓度成正比。当将这 些信号放大并记录下来时，就是气相色谱图了。
1.8 总结-气相色谱分析步骤
★开机：连好流路，先开载气、氢气、空气，再开打开GC仪
器，再打开计算机 ★设定流量、温度、检测器参数 ★用默认处理参数进行样品分析 ★根据图谱调整分析条件，再分析样品，直至得到理想谱图 ★确定定量方法（内标、外标、面积归一等） ★选择校正点数，编辑ID表（输入组分的保留时间和标样浓 度） ★选择校正次数（每浓度取几次均值） ★选择曲线计算方式（直线、最小二乘或折线） ★按从低浓度到高浓度的顺序，分析完所有标样，即完成曲 线制作 ★进行未知样分析，每次分析结束，自动计算定量结果 ★分析完了，关机，系统降温后，关闭工作站窗口。关载气。 关闭GC主机电源。
1.3气相色谱仪的基本结构
图示
气相色谱主机
温度控制区
钢瓶 He,N2 进样口 色谱柱 检测器 数据 处理
1.4进样口、色谱柱、检测器的温度设定
1. 进样口温度 考虑样品中各组分的沸点，设定温度使样品瞬间 汽化。 2.色谱柱温度 考虑样品中各组分的沸点，及希望的分析周期， 宽沸程样品应使用程序升温。 3.检测器温度 防止检测器污染，一般比色谱柱温度高20-30℃。 根据炭数确定分析条件
常常采用已知物对照法，即往样品中加入某一纯物质 （对照品），混匀进样。对比加入前后的色谱图，若加 入后某峰相对增高，则该组分与对照品为同一物质。 2.化学鉴别法 化学鉴别法是利用专属性化学反应对分离后收集的组分 进行定性分析。此法只能鉴别组分属于哪一类化合物。 通常是收集色谱馏分，再与官能团分类试剂反应。有关 官能团鉴别试剂可查阅有关文献。
43 57 29 15 71 85 99 113 142 m/z
3.2质谱分析特点：
• 应用范围广；
• 灵敏度高，样品用量少；
• 分析速度快，并可实现多组分同时测定；
• 与其它仪器相比，仪器结构复杂，价格昂 贵，使用及维修比较困难； • 对样品有破坏性，无法回收。
3.3质谱法的产生机理及基本过程
色谱基础知识简介
• 气相色谱
• 高效液相色谱法（high performance liquid chromatography, HPLC） • 质谱基础知识
1.1气相色谱特点
气相色谱法是指用气体作为流动相的 色谱法。由于样品在气相中传递速度快， 因此样品组分在流动相和固定相之间可以 瞬间地达到平衡。另外加上可选作固定相 的物质很多，因此气相色谱法是一个分析 速度快和分离效率高的分离分析方法。近 年来采用高灵敏选择性检测器，使得它又 具有分析灵敏度高、应用范围广等优点。
• 编制本教材的任务是给车间员工进行培训。 且已经有对应的模版了，模板中所涉及的大 纲你到教材中都需要体现出来，如：目的、 原理、规范操作（送样、取样、看分析结 果等方面的）、操作存在的风险（取样操 作如何取出具有代表性的样品等方面）。 总体而言，你到这份讲义的侧重点应该 在如何规范取样、送样、看分析结果。这 些的前天是需要对GC、LC有相关的了解。 可以结合一些图片说明。
三、定量分析方法 HPLC定量分析的参数是色谱峰高和峰面积，定量依据 是样品中组分的量（或浓度）与峰高或峰面积成正比。 常用的定量方法有外标法、内标法。 1.外标法 用与待测组分同质的标准品作对照品，以对照品的量 对比求算试样含量的方法称为外标法。外标法分为外标 工作曲线法、外标一点法和外标两点法等。只要待测组 分出峰、无干扰、保留时间适宜，即可用外标法进行定