生物化学实验碱性磷酸酶的分离提取及比活力的
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验 碱性磷酸酶的分离提取 及比活力的测定
目的要求： 1.学习蛋白质分离纯化的一般原理和步骤 1.学习蛋白质分离纯化的一般原理和步骤 2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技术及比活 2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技术及比活 测定的方法
1.原理 1.原理
碱性磷酸酶 (Alkaline phosphatase EC 3.1.3.1 简称为ALPase) 简称为ALPase) 广泛存在于微生物界和动物界。 ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应， ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应， 产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以 催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯 转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。
上述分离提取的三步酶制剂按一定比例用 Tris-HCl缓冲液稀释，稀释倍数视溶液的蛋 Tris-HCl缓冲液稀释，稀释倍数视溶液的蛋 白浓度高低而定。（一般稀释5 10倍）。 白浓度高低而定。（一般稀释5-10倍）。
3.3 结果处理 计算：
酶活力(U/mL) = B t ⋅ V1 C ⋅A V2
蛋白浓度(mg/mL) =
上清液
缓慢加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度（100 mL加入20.9 缓慢加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度（100 mL加入20.9 g），不断搅拌溶解，置冰箱静置1 h。 ），不断搅拌溶解，置冰箱静置1 h。 室温离心，4000 室温离心，4000 r/m 20 min，收集离心上清液，并量体积。 min，收集离心上清液，并量体积。 0.35饱和硫酸铵上清液 0.35饱和硫酸铵上清液 加入固体研磨细粉的硫酸铵至0.70饱和度（100 mL加入23.8 g）。 加入固体研磨细粉的硫酸铵至0.70饱和度（100 mL加入23.8 g）。 缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置2 h。 缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置2 h。 室温离心，4000 室温离心，4000 r/m 20 min，收集沉淀物。 min，收集沉淀物。
0.1 mol/L NaOH (mL) 酶液（mL） OD 405 nm
以0号管调零点，测定各管的OD405nm值，从对照标准曲线求出产 物的µmol数，算出酶活力。
管号
1
1'
2
2'
3
3'
4
4'
5
5'
加酶时 0.5 m 间 （min） min） 加 NaOH 时间
1m 1.5m 2m
2.5m 3m
式中：A为稀释倍数，B为由标准曲线查得的pNP µmol数，t为反应时间，C为由标准曲线查得的蛋白 mg数，V1为测定酶活力所用的酶量(mL数) V2为测定 酶活力所用的酶量(mL数) 酶的比活力（U/mg）＝ 酶活力（U/mL） 蛋白浓度（mg/mL） 纯化倍数=各步比活力/第一步比活力 得率%=各步总活力*100/第一步总活力
沉淀
溶于5 mL含 溶于5 mL含0.1 mol/L NaCl 的0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5。装入透 Tris7.5。装入透 析袋，对0.01 析袋，对0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5缓冲液透析平衡，至无SO42-被 Tris7.5缓冲液透析平衡，至无SO 检测出为止
匀浆过滤液 正丁醇处理上清液 0.35饱和(NH4)2SO4上 清液 0.7饱和(NH4)2SO4沉淀 溶解透析上清液 DEAE-32酶液 Sephadex G75酶液 Sephadex G200酶液
4.注意事项 4.注意事项 （1）在加硫酸铵时，需事先将硫酸铵粉末研细。加 入过程需缓慢并及时搅拌溶解。搅拌要缓慢，尽 量防止泡沫的形成，以免酶蛋白在溶液中表面变 性。 （2）测活时可以将待测定的试管置于试管架放入水 浴锅中预热及反应。 （3）紫外分光光度测定需用石英杯。 （4）稀释倍数 （5）移液器的使用
(1)
(2)
(3)
在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变 性而失活，为了获得较好的分离提取效果，在工作 中特别注意以下几点： 取用新鲜的材料，提取工作应在获得材料后立刻开 始，否则应在低温下保存。选择来源丰富，酶含量 高的材料。 用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫 酸铵在水中溶解度很大（20℃，每升可溶760克）， 酸铵在水中溶解度很大（20℃，每升可溶760克）， 并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的 盐。 在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的 活力和比活力。唯有比活力提高较大，提纯步骤才 有效。
返回
酶活力的分析：通常是以对酶活力的分析：通常是以对-硝基苯磷酸二钠 （pNPP）为底物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液（含2 pNPP）为底物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液（含2 mmol/L Mg2+）的测活体系中检测酶催化pNPP水解 ）的测活体系中检测酶催化pNPP水解 产生黄色的对硝基苯酚（pNP）的量。产物pNP在 产生黄色的对硝基苯酚（pNP）的量。产物pNP在 405 nm处有最大的吸收峰，可以根据OD405 nm 值 nm处有最大的吸收峰，可以根据OD 的增加计算酶活力的大小。 酶活力定义为：在37℃下，以2 酶活力定义为：在37℃下，以2 mmol/L pNPP为底 pNPP为底 物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液含2 物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg2+的 测活体系中每分钟催化产生1 测活体系中每分钟催化产生1 µmol/L pNP的酶量定 pNP的酶量定 为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所 个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所 具有的酶活力单位数。 蛋白质浓度的测定常采用福林-酚试剂（Folin蛋白质浓度的测定常采用福林-酚试剂（FolinPhenol reagent）显色法 reagent）显色法
操作方法 3.1 牡蛎碱性磷酸酶的分离提取 (1) 每组称取20 g牡蛎（蒸馏水洗净），加入50 mL 每组称取20 牡蛎（蒸馏水洗净），加入50 预先冷却的0.01 预先冷却的0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.5， Tris缓冲液（pH 7.5， 含0.1 mol/L NaCl），（两组一起）于高速组织 NaCl），（两组一起）于高速组织 捣粹机匀浆1 min，于冰箱4 放置1 h进行抽提。 捣粹机匀浆1 min，于冰箱4℃放置1 h进行抽提。 (2) 室温离心，3000 r/m 20 min，收集离心上清液， 室温离心，3000 min，收集离心上清液， （两组分开）并量体积。（留2 mL上清液，待 （两组分开）并量体积。（留2 mL上清液，待 测酶的比活力。） (3) 在上清液中加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱 在上清液中加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱 和度（100 mL加入20.9 g）。缓慢加入，不断搅 和度（100 mL加入20.9 g）。缓慢加入，不断搅 拌溶解，置冰箱静置1 h。 拌溶解，置冰箱静置1 h。 (4) 室温离心，3000 r/m 20 min，收集离心上清液， 室温离心，3000 min，收集离心上清液， 并量体积。（留2 mL上清液，对0.01 并量体积。（留2 mL上清液，对0.01 mol/L TrisTrisHCl 缓冲液pH 7.5含0.1 mol/L NaCl 透析平衡， 缓冲液pH 7.5含 待测酶的比活力。）
OD
2 0.2 0.6
3 0.3 0.5
4 0.4 0.4
5 0.5 0.3
6 0.6 0.2
7 0.7 0.1
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35
各管加入1.0 mL 各管加入0.2 mL 各管加入2.0 mL
以对硝基苯酚的绝对量(µmol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标， 绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数(ε)值。 ε＝8.80×103( mol/L)-1﹒cm-1
3.2.2 酶活力的测定
管 号 5 mM pNPP(mL) Na2CO3-NaHCO3 (mL) 20 mmol/L MgCl2 (mL) H2O (mL) 酶液（mL）
空白
1
2 各0.2mL
3
各管加入1.0 mL 各管加入0.2 mL 各0.50mL / 混匀，37℃ 混匀，37℃，5分钟 各0.1mL 37℃，精确反应10分钟 37℃，精确反应10分钟 各管加入2.0 mL 0.1mL
3
(5) 0.35饱和硫酸铵上清液，加入固体研磨细粉的硫酸 0.35饱和硫酸铵上清液，加入固体研磨细粉的硫酸 铵至0.70饱和度（100 mL加入23.8 g）。缓慢加入， 铵至0.70饱和度（100 mL加入23.8 g）。缓慢加入， 不断搅拌溶解，置冰箱静置2 h。 不断搅拌溶解，置冰箱静置2 h。 (6)室温离心，4000 r/m 20 min，收集沉淀物。 (6)室温离心，4000 min，收集沉淀物。 (7) 得到沉淀物，溶于5 mL含0.1 mol/L NaCl 的0.01 得到沉淀物，溶于5 mL含 mol/L Tris-HCl pH 7.5。装入透析袋，对0.01 mol/L Tris7.5。装入透析袋，对0.01 TrisTris-HCl pH 7.5缓冲液透析平衡，至无SO42-被检测 7.5缓冲液透析平衡，至无SO 出为止（可用一定浓度BaCl 出为止（可用一定浓度BaCl2溶液检验）。 (8) 取出酶溶液，冷冻高速离心（0℃ 25000 r/m 30 取出酶溶液，冷冻高速离心（0 min）。 min）。 (9) 离心上清液即为粗酶制剂，检测酶的比活力。装入 棕色瓶于4 棕色瓶于4℃冰箱保存。
粗酶液
3.2 比活力测定 3.2.1 对硝基苯酚标准曲线的制作（不做）： 对硝基苯酚标准曲线的制作（不做） 取15支试管编号，0号一支，1－7号各二支，按下列表格操作。 15支试管编号，0号一支，1
管 号 pNP含量 (µmol) 0.5µmol/mL pNP (mL) H2O (mL) Na2CO3-NaHCO3 (mL) 20 mmol/L MgCl2 (mL) 0.1 mol/L NaOH (mL)
将测定的数据或计算结果用下表记录。（本实验不做）
步骤 总体 积 mL 400 470 440 40.3 9.6 13.2 6.8 3.82 0.49 0.21 蛋白 mg/ mL 7.24 总蛋 白 mg 酶活 力 U/m L 20.3 33.8 35.3 314.7 1002. 2 451.5 509.3 总活 力 U 比活 力 U/m g 纯 化 倍 数 得 率 %
3.5 m
4m
4.5m 5m
10.5 11
11.5
12
12.5
13
13.5 14
14.5
15
反应时 10 间 （min） min）
10
10
10
10
10
10
10
10
10
3.2.3蛋白浓度的测定 3.2.3蛋白浓度的测定
本实验采用紫外吸收法（OD280）测定蛋白浓度。 本实验采用紫外吸收法（OD280）测定蛋白浓度。
20 g牡蛎
匀浆液
加入50 mL预先冷却的0.01 加入50 mL预先冷却的0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.5， Tris缓冲液（pH 7.5， 含0.1 mol/L NaCl），于高速组织捣粹机匀浆1 min，于冰箱 NaCl），于高速组织捣粹机匀浆1 min，于冰箱 4℃放置1 h进行抽提。 放置1 h进行抽提。 室温离心，4000 室温离心，4000 r/m 20 min，收集离心上清液，并量体积。 min，收集离心上清液，并量体积。
目的要求： 1.学习蛋白质分离纯化的一般原理和步骤 1.学习蛋白质分离纯化的一般原理和步骤 2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技术及比活 2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技术及比活 测定的方法
1.原理 1.原理
碱性磷酸酶 (Alkaline phosphatase EC 3.1.3.1 简称为ALPase) 简称为ALPase) 广泛存在于微生物界和动物界。 ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应， ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应， 产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以 催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯 转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。
上述分离提取的三步酶制剂按一定比例用 Tris-HCl缓冲液稀释，稀释倍数视溶液的蛋 Tris-HCl缓冲液稀释，稀释倍数视溶液的蛋 白浓度高低而定。（一般稀释5 10倍）。 白浓度高低而定。（一般稀释5-10倍）。
3.3 结果处理 计算：
酶活力(U/mL) = B t ⋅ V1 C ⋅A V2
蛋白浓度(mg/mL) =
上清液
缓慢加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度（100 mL加入20.9 缓慢加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度（100 mL加入20.9 g），不断搅拌溶解，置冰箱静置1 h。 ），不断搅拌溶解，置冰箱静置1 h。 室温离心，4000 室温离心，4000 r/m 20 min，收集离心上清液，并量体积。 min，收集离心上清液，并量体积。 0.35饱和硫酸铵上清液 0.35饱和硫酸铵上清液 加入固体研磨细粉的硫酸铵至0.70饱和度（100 mL加入23.8 g）。 加入固体研磨细粉的硫酸铵至0.70饱和度（100 mL加入23.8 g）。 缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置2 h。 缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置2 h。 室温离心，4000 室温离心，4000 r/m 20 min，收集沉淀物。 min，收集沉淀物。
0.1 mol/L NaOH (mL) 酶液（mL） OD 405 nm
以0号管调零点，测定各管的OD405nm值，从对照标准曲线求出产 物的µmol数，算出酶活力。
管号
1
1'
2
2'
3
3'
4
4'
5
5'
加酶时 0.5 m 间 （min） min） 加 NaOH 时间
1m 1.5m 2m
2.5m 3m
式中：A为稀释倍数，B为由标准曲线查得的pNP µmol数，t为反应时间，C为由标准曲线查得的蛋白 mg数，V1为测定酶活力所用的酶量(mL数) V2为测定 酶活力所用的酶量(mL数) 酶的比活力（U/mg）＝ 酶活力（U/mL） 蛋白浓度（mg/mL） 纯化倍数=各步比活力/第一步比活力 得率%=各步总活力*100/第一步总活力
沉淀
溶于5 mL含 溶于5 mL含0.1 mol/L NaCl 的0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5。装入透 Tris7.5。装入透 析袋，对0.01 析袋，对0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5缓冲液透析平衡，至无SO42-被 Tris7.5缓冲液透析平衡，至无SO 检测出为止
匀浆过滤液 正丁醇处理上清液 0.35饱和(NH4)2SO4上 清液 0.7饱和(NH4)2SO4沉淀 溶解透析上清液 DEAE-32酶液 Sephadex G75酶液 Sephadex G200酶液
4.注意事项 4.注意事项 （1）在加硫酸铵时，需事先将硫酸铵粉末研细。加 入过程需缓慢并及时搅拌溶解。搅拌要缓慢，尽 量防止泡沫的形成，以免酶蛋白在溶液中表面变 性。 （2）测活时可以将待测定的试管置于试管架放入水 浴锅中预热及反应。 （3）紫外分光光度测定需用石英杯。 （4）稀释倍数 （5）移液器的使用
(1)
(2)
(3)
在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变 性而失活，为了获得较好的分离提取效果，在工作 中特别注意以下几点： 取用新鲜的材料，提取工作应在获得材料后立刻开 始，否则应在低温下保存。选择来源丰富，酶含量 高的材料。 用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫 酸铵在水中溶解度很大（20℃，每升可溶760克）， 酸铵在水中溶解度很大（20℃，每升可溶760克）， 并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的 盐。 在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的 活力和比活力。唯有比活力提高较大，提纯步骤才 有效。
返回
酶活力的分析：通常是以对酶活力的分析：通常是以对-硝基苯磷酸二钠 （pNPP）为底物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液（含2 pNPP）为底物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液（含2 mmol/L Mg2+）的测活体系中检测酶催化pNPP水解 ）的测活体系中检测酶催化pNPP水解 产生黄色的对硝基苯酚（pNP）的量。产物pNP在 产生黄色的对硝基苯酚（pNP）的量。产物pNP在 405 nm处有最大的吸收峰，可以根据OD405 nm 值 nm处有最大的吸收峰，可以根据OD 的增加计算酶活力的大小。 酶活力定义为：在37℃下，以2 酶活力定义为：在37℃下，以2 mmol/L pNPP为底 pNPP为底 物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液含2 物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg2+的 测活体系中每分钟催化产生1 测活体系中每分钟催化产生1 µmol/L pNP的酶量定 pNP的酶量定 为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所 个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所 具有的酶活力单位数。 蛋白质浓度的测定常采用福林-酚试剂（Folin蛋白质浓度的测定常采用福林-酚试剂（FolinPhenol reagent）显色法 reagent）显色法
操作方法 3.1 牡蛎碱性磷酸酶的分离提取 (1) 每组称取20 g牡蛎（蒸馏水洗净），加入50 mL 每组称取20 牡蛎（蒸馏水洗净），加入50 预先冷却的0.01 预先冷却的0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.5， Tris缓冲液（pH 7.5， 含0.1 mol/L NaCl），（两组一起）于高速组织 NaCl），（两组一起）于高速组织 捣粹机匀浆1 min，于冰箱4 放置1 h进行抽提。 捣粹机匀浆1 min，于冰箱4℃放置1 h进行抽提。 (2) 室温离心，3000 r/m 20 min，收集离心上清液， 室温离心，3000 min，收集离心上清液， （两组分开）并量体积。（留2 mL上清液，待 （两组分开）并量体积。（留2 mL上清液，待 测酶的比活力。） (3) 在上清液中加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱 在上清液中加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱 和度（100 mL加入20.9 g）。缓慢加入，不断搅 和度（100 mL加入20.9 g）。缓慢加入，不断搅 拌溶解，置冰箱静置1 h。 拌溶解，置冰箱静置1 h。 (4) 室温离心，3000 r/m 20 min，收集离心上清液， 室温离心，3000 min，收集离心上清液， 并量体积。（留2 mL上清液，对0.01 并量体积。（留2 mL上清液，对0.01 mol/L TrisTrisHCl 缓冲液pH 7.5含0.1 mol/L NaCl 透析平衡， 缓冲液pH 7.5含 待测酶的比活力。）
OD
2 0.2 0.6
3 0.3 0.5
4 0.4 0.4
5 0.5 0.3
6 0.6 0.2
7 0.7 0.1
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35
各管加入1.0 mL 各管加入0.2 mL 各管加入2.0 mL
以对硝基苯酚的绝对量(µmol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标， 绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数(ε)值。 ε＝8.80×103( mol/L)-1﹒cm-1
3.2.2 酶活力的测定
管 号 5 mM pNPP(mL) Na2CO3-NaHCO3 (mL) 20 mmol/L MgCl2 (mL) H2O (mL) 酶液（mL）
空白
1
2 各0.2mL
3
各管加入1.0 mL 各管加入0.2 mL 各0.50mL / 混匀，37℃ 混匀，37℃，5分钟 各0.1mL 37℃，精确反应10分钟 37℃，精确反应10分钟 各管加入2.0 mL 0.1mL
3
(5) 0.35饱和硫酸铵上清液，加入固体研磨细粉的硫酸 0.35饱和硫酸铵上清液，加入固体研磨细粉的硫酸 铵至0.70饱和度（100 mL加入23.8 g）。缓慢加入， 铵至0.70饱和度（100 mL加入23.8 g）。缓慢加入， 不断搅拌溶解，置冰箱静置2 h。 不断搅拌溶解，置冰箱静置2 h。 (6)室温离心，4000 r/m 20 min，收集沉淀物。 (6)室温离心，4000 min，收集沉淀物。 (7) 得到沉淀物，溶于5 mL含0.1 mol/L NaCl 的0.01 得到沉淀物，溶于5 mL含 mol/L Tris-HCl pH 7.5。装入透析袋，对0.01 mol/L Tris7.5。装入透析袋，对0.01 TrisTris-HCl pH 7.5缓冲液透析平衡，至无SO42-被检测 7.5缓冲液透析平衡，至无SO 出为止（可用一定浓度BaCl 出为止（可用一定浓度BaCl2溶液检验）。 (8) 取出酶溶液，冷冻高速离心（0℃ 25000 r/m 30 取出酶溶液，冷冻高速离心（0 min）。 min）。 (9) 离心上清液即为粗酶制剂，检测酶的比活力。装入 棕色瓶于4 棕色瓶于4℃冰箱保存。
粗酶液
3.2 比活力测定 3.2.1 对硝基苯酚标准曲线的制作（不做）： 对硝基苯酚标准曲线的制作（不做） 取15支试管编号，0号一支，1－7号各二支，按下列表格操作。 15支试管编号，0号一支，1
管 号 pNP含量 (µmol) 0.5µmol/mL pNP (mL) H2O (mL) Na2CO3-NaHCO3 (mL) 20 mmol/L MgCl2 (mL) 0.1 mol/L NaOH (mL)
将测定的数据或计算结果用下表记录。（本实验不做）
步骤 总体 积 mL 400 470 440 40.3 9.6 13.2 6.8 3.82 0.49 0.21 蛋白 mg/ mL 7.24 总蛋 白 mg 酶活 力 U/m L 20.3 33.8 35.3 314.7 1002. 2 451.5 509.3 总活 力 U 比活 力 U/m g 纯 化 倍 数 得 率 %
3.5 m
4m
4.5m 5m
10.5 11
11.5
12
12.5
13
13.5 14
14.5
15
反应时 10 间 （min） min）
10
10
10
10
10
10
10
10
10
3.2.3蛋白浓度的测定 3.2.3蛋白浓度的测定
本实验采用紫外吸收法（OD280）测定蛋白浓度。 本实验采用紫外吸收法（OD280）测定蛋白浓度。
20 g牡蛎
匀浆液
加入50 mL预先冷却的0.01 加入50 mL预先冷却的0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.5， Tris缓冲液（pH 7.5， 含0.1 mol/L NaCl），于高速组织捣粹机匀浆1 min，于冰箱 NaCl），于高速组织捣粹机匀浆1 min，于冰箱 4℃放置1 h进行抽提。 放置1 h进行抽提。 室温离心，4000 室温离心，4000 r/m 20 min，收集离心上清液，并量体积。 min，收集离心上清液，并量体积。