液相芯片

液相芯片技术及其临床应用
生物芯片主要包括基因芯片和蛋白芯片两大类，按寻址方式和最终检测载体又可分为固相芯片(flat microarrays)和液相芯片(1iquid chip or microsphere arrays)。

近年来，液相芯片以其独特的优点及临床实用性，正受到越来越多的重视。

现就液相芯片的技术原理、特点及临床应用前景作简要介绍。

【摘要】液相芯片技术是一种利用混悬在液相中的分类编码微球作为反应及信号检测载体的检测技术，它充分利用发展成熟的流式细胞术检测原理，对临床大多数生物分子（如核酸、蛋白质等）进行高通量分析。

目前已在研究和临床检测中得到了广泛的应用，现就其技术原理、特点及临床应用作简要介绍。

【关键词】芯片分析技术流式细胞术
生物芯片主要包括基因芯片和蛋白芯片两大类，按寻址方式和最终检测载体又可分为固相芯片(flat microarrays)和液相芯片(1iquid chip or microsphere arrays)。

近年来，液相芯片以其独特的优点及临床实用性，正受到越来越多的重视。

现就液相芯片的技术原理、特点及临床应用前景作简要介绍。

液相芯片技术原理
1．微球编码与反应原理：固相芯片通过空间位置寻址来识别不同点阵元素(即区别不同的特异性反应)，液相芯片则通过反应载体——微球所具有的物理、光学信号(如大小或颜色)来识别点阵元素⋯。

液相芯片技术是一种以经过特殊编码、可识别的微球(encoded microspheres or beads)作为生物分子(抗原、抗体、蛋白质、核酸等)反应及信号检测载体的阵列分析技术。

液相芯片采用的分子杂交反应类型与固相芯片类似，只是所有的反应在混悬于液相中的微球表面上进行，故也称为悬浮式点阵技术(suspension array technology，SAT)。

SAT技术主要包括点阵信号识别和检测信号识别两部分，现以临床最常用的双位点夹心法来说明液相芯片的基本技术原理。

SAT主要由微球、探针分子(A)、被检测物(B)、报告分子(c)4个部分构成。

微球的主要化学成分为聚苯乙烯，其表面修饰的羧基功能基团在一定条件下可以共价结合任何含有氨基的目标分子，对其表面进行不同的化学结构修饰，可使结合的目标分子更具选择性。

将微球采用物理或化学方法进行编码分类，不同编码类别的微球即可区分不同的特异性反应。

微球编码方式多种多样]，如微球大小、颜色、荧光金属纳米技术等，其中最常用的是荧光编码技术，即在制备过程中掺人两种或多种不同颜色分类荧光分子，根据加入比例不同将同种大小的微球进行独特编码。

探针分子是可以和微球表面的羧基等基团偶联并能与被检测物特异性结合的生物分子。

报告分子的作用是为每种不同的特异性反应提供检测信号，其可以是一种能与被检测物特异性结合的荧光染料，也可以是标记有荧光的、能与被检测物结合的其他物质(如抗体、抗原、核酸等)。

为了和微球分类荧光有明显区别，一般以绿色荧光作为报告分子的标记荧光，任何一种可以激发绿色荧光的荧光染料均可作为报告分子的荧光标记物。

将不同编码类别的微球分别与不同的探针分子反应结合后，混合在一起，再依次加入样品及报告分子，不同微球上的探针分子与样品中需要检测的各种目标分子进行特异性结合，报告分子与目标分子特异性结合，即构成了一个液相芯片系统。

因此，可在同一混悬体系中对同一样品中的多种目标分子进行同时分析。

2．检测原理：微球编码技术不同，信号的检测方式也各不相同。

流式细胞术是目前应用最广、技术最成熟的一种信号识别和检测技术。

微球单个逐一通过检测通道时受到双色激光(如红色和绿色)同时照射，第一束激光激发微球的分类荧光，根据荧光编码确定微球的类别，即微球内部的两种荧光物质受激发后可发射两种不同波长的荧光，不同类别微球内这两种荧光物质比例不同，则荧光强度比率也不同，从而将不同的特异性反应区分开来(定性、分类)；第二束激光激发报告分子
上的荧光素，根据荧光强度确定微球上结合的报告分子的数量，从而确定目标分子数量(定量)[3] 系统只记录与红色荧光同时出现的绿色荧光信号，不记录未结合的报告分子荧光信号，因此检测前无需洗脱未结合的报告分子。

此外，利用流式细胞术中9O。

角散射光可有效地消除微球聚集对结果造成的影响[1]。

各种信号经分析软件进行数字化处理，可获得检测物的种类和数量。

单核苷酸多态性检测的液相芯片技术单核苷酸多态性(SNP)是人类基因组中单个碱基的变异，属于二等位基因的标记，在人类30亿个碱基中每千个碱基出现一次，是近来被受关注的第三代多态性标记。

由于SNP的研究将会极大地推动群体遗传学、药物开发、法医学、癌症、糖尿病、精神病等复杂疾病研究，故近年来不断有新的技术及方法出现并应用于SNP的检测。

单核苷酸多态性(SNP)是人类基因组中单个碱基的变异，属于二等位基因的标记，在人类30亿个碱基中每千个碱基出现一次，是近来被受关注的第三代多态性标记。

由于SNP的研究将会极大地推动群体遗传学、药物开发、法医学、癌症、糖尿病、精神病等复杂疾病研究，故近年来不断有新的技术及方法出现并应用于SNP的检测。

利用芯片技术进行SNP多态性位点的检测是目前发展最快、最有应用前景的技术平台。

本文所介绍的这一技术平台在2003年10月的《Scientific Computing & Instrumentation》杂志上被认为是计算机技术发展史上的20个里程碑技术之一。

该技术最早是由Orchid BioSciences 公司研发，并成功应用于美国纽约“9·1 1”恐怖袭击事件中遇难者的身份鉴定工作（详见2003年12月期的《生物技术世界》杂志）。

随后，贝克曼库尔特公司的科学家们发展了这一技术，在自动化程度方面及荧光检测技术方面进行了改进和提升，充分利用了芯片技术的高通量、高信息量的特性，使得SNP位点检测更加准确。

该技术运用经典的单碱基引物延伸技术，结合多重PCR技术及荧光标记技术，同时引入384孔液相芯片杂交技术，原理简单，结果可靠，准确性超过了DNA测序，且每个SNP基因型分析只需170 ng 的DNA样本。

主要特点如下：1、更高、更灵活的通量
384孔杂交芯片，每孔可同时检测12个SNP位点。

每日检测通量可达4,608-800,000 个SNP 位点。

384孔板上的每一个孔内都预先固定了12个序列已知的独特的寡核苷酸片段及4个对照标记(Tag)。

板上的每一个Tag片段都能与12个含有Tag互补序列的SNP延伸引物中的一个互补，再加上4个对照的寡核苷酸片段，以确保结果的准确性。

单碱基引物延伸反应完成后，将被转移到已含有特定寡核苷酸序列的微阵列芯片板上，由于Tag芯片技术能够严格按照已知的Tag序列设定杂交条件，所有杂交反应都是动态的液相杂交，良好的均一性和引物的高度特异性使得Tag芯片拥有比其它SNP筛查技术更高的准确性、杂交效率及重现性。

2、真正的多重SNP检测
每对PCR引物及一个SNP引物都由网络版的自动引物设计软件来完成。

该软件可同时完成12对PCR引物及12个SNP引物的设计以保证多重SNP检测的成功。

每个完成的SNP引物都自动接有特定的Tag标签序列，此序列与预先种植在每个384孔板内的寡核苷酸探针序列互补，以便进行SNP位点的精确检测。

3、更低的成本，更高的效率
5ml的反应体系、12重的PCR反应及复合的SNP反应不仅仅降低了PCR反应的费用，还提高了效率，其最终的结果既保证了结果的一致，又可使每个SNP基因分型的成本降到最低。

一个PCR反应可同时检测12个SNP位点，省时、省钱、省人力。

4、更少的DNA 用量，更精确的基因分型
2ng 的DNA可用于12个SNP 位点的检测，准确率在99%以上。

由于单个延伸的碱基带有荧光标记，检测结果可由荧光芯片扫描仪上的双色荧光读出并分析。

由于SNP位点在基因组中数量多，分布稳定，且是一种双等位基因标记，易于使用高通量、自动化的技术平台检测。

相信这一技术一定会在个体识别、复杂疾病研究和药物遗传学研究中发挥应有的作用。

欧洲正在研发的悬臂阵列
2000 年4月的《科学》杂志(Science，vol 288)报导了瑞士苏黎世IBM 实验室和巴塞尔大学的一项新成果：使用由硅制的微小机械可以测出DNA的缺陷，对未来医学治疗和病理诊断设备的开发具有深远意义。

如此微小的机械也可称作生物芯片(biochip)或生物传感器(biosensor)。

其理论是，直接将特定的生化识别转化为纳米机械运动，机械运动将被由不同机理集成化的监控器所观测，计算机将对其观测的光信号或电信号进行比较分析，从而达到对生化分子的识别及其它特定化学反应的监控。

其生物传感器中感应部分常用的一种是悬臂传感器(cantileve r sensor)。

(图1)
悬臂的大小决定了其传感器的灵敏性，现有的硅纳米刻蚀技术可制造出宽度小于50纳米的悬臂，当器件尺度缩小到纳米级的时候，灵敏度将会大幅度提高。

通过覆盖具有选择吸附性材料于表面，约束目标对象的悬臂就具有高度灵敏性的选择化学与生化物的传感器。

当传感器被目标物质所接触，其表面应力发生改变，致使悬臂发生弯曲，并且通过检控打在器件表面的激光反射光路，从而得到监控信号，其信号将被用来进行物质识别，同时能非常精确的测出其含量，并且可以进行动态化学反应监控(图2)。

欧共体的另一个利用悬臂的传感器项目NANOMASS，由瑞典、丹麦和西班牙等多个研究所合作开发新型传感器，代替对表面应力的测量，通过检控悬臂频率来实现，不同的分子吸附表面将会改变悬梁的共振频率，恰恰共振频率的改变可用来进行物质的质量识别，其纳米机械设备将集成于CMOS的芯片上，且无须激光之类的光学检控系统，并且利用半导体芯片生产技术来提高其传感器的集成化与智能化。

悬臂传感器将传统的化学反应直接从微米至纳米的机械器件上测出无标记(lable-free)传感器，这种方法直接减少了生物分子检测的步骤和排除标记基体对样品结果的影响。

此传感器的一个很大优势是可以对混合物进行检样与分析，无须花时间进行纯化分离，并且与人造智能网络连接，可以用电子鼻识别复杂混合气。

并且有广阔的应用领域如医学诊断、药物研发、生命科学研究、食物分析、芳香味道分析和环境检控等。

生命科学与半导体电子技术的结合将会使智能电子医生成为现实。