电子克隆及序列分析

常用软件及网络资源简介

EditSeq是输入并且修剪DNA或蛋白质序列的工具。 EditSeq能读取大部分的序列格式，也可以通过使 用键盘输入，或者从其他地方复制、粘贴得到。 序列被打开后，EditSeq能使用标准或者指定的遗 传密码进行翻译或反翻译、寻找开放读框以及进 行阅读校对
优点与缺点的讨论
传统的方法如同小规模地捕捞一条或几条鱼，电子克隆与之相比就如 同集约化地捕捞一群鱼

拼图游戏一样的原理

相近的物种在核酸序列上有相似性，相近物种中 的同源基因序列在一定程度上可以代表目的基因
的序列

可代表程度与两序列的相似度直接相关，加之遗
传密码的简并性，这种混同在理论上是可行的 ，
但需要作同源性检验以克服主观因素的影响
可能在这个物种上没有被测序。
（2）已已经测序得到的一段EST为探针。
（二）基于UNIGENE的电子克隆
2. 搜索同源的ESTs,选择同源性比分最高的一条 EST序列。从NCBI的UniGene数据库中进行检 索，得到相应的UniGene编号。 3. 可以将与UniGene Cluster的所有核酸序列下载
接cDNA序列以期挖掘新基因

另一方面是在全基因组已经测序的物种中，研究 整个基因组序列以推测其中可能尚未发现的基因

目前应用比较广泛的是第一方面
应用





数据库查询 数据库比对 文件下载 序列分析 序列装配 分子模型 结构分析 功能分析
应用

在全基因组已经测序的物种中推测新基因的步骤 如下： 分析和定位开放阅读框 虚拟翻译并对多肽链序列检索比对 可靠性检查
（一）基于EST的电子克隆
2. 搜索同源的ESTs,并下载到本地，成为 *.SEQ文件格式
采用Blast在线根据搜索与探针相似性高 （>80％）的大量ESTs，
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
（一）基于EST的电子克隆
3. 拼接
采用DNASTAR6.0的Seqman程序进行。
启动子预测
（ 1 ） CpGProD(CpG Island Promoter Detection) ， CpG 岛启动子鉴定， 是一款专注于预测哺乳动物 CpG 岛相关启动子序列的程序。可以下载下 来运行 : http://pbil.univ-lyonl.fr/software/cpgprod_query.html （ 2 ） Dragon Promoter Finder 启动子预测工具，适用于预测脊椎动物 启动子，支持多种序列格式，多参数可选。 http://research.12r.a-star.edu.sg/promoter/promoter1_5/DPF.hm （ 3 ） McPromoter, Markov Chain Promoter Prediction Server 是麻省理 工大学开发的真核生物 ( 主要是脊椎动物 / 果蝇 )DNA 转录起始位点预测 工具，其目标是尽量精确地预测 RNA 转录酶 II 的启示转录位点，需要提 供一个 Email 来接收预测结果，可以特异的选择脊椎动物或是果蝇。 http://tools.genome.duke.edu/generegulation/McPromoter/ （ 4 ） PromoterScan 启动子区预测工具，其预测基于比较所提交的序列 与真核生物 RNA 聚合酶 II 启动子序列同源性。 http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/prosean/ （ 5 ） TESS, Transcription Element Search System 是一款预测启动子 上转录因子结合位点的工具，通过所提交的序列与 TRANSFAC, JASPAR, IMD, CBIL-GibbsMat 数据库相比对，获得启动子上可能存在结合位点。 http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess?RQ=SEA-FR-Query
到本地，利用Seqman或其他的序列装配软件进
行组装，形成较长的新生序列。
常用软件及网络资源简介

DNAStar是一款电子克隆中常用的软件包，它以 功能全面和强大而著称，它主要包括以下几个应 用程序：EditSeq、GeneMan、GeneQuest、 MapDraw、MegAlign、PrimerSelect、Protean、 和SeqMan II
5. ORF预测：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html
6. 基因的电子表达谱预测: UNIGENE
电子克隆序列的生物信息学分析
7. DNA序列查找 8. 基因的电子定位: 与基因组比对。 9. 基因结构预测：http://www.itb.cnr.it/sun/webgene//
注意：对序列进行末段修剪去掉冗余部分。
（一）基于EST的电子克隆
3. 拼接
采用DNASTAR6.0的Seqman程序进行。
注意：序列剔除，以提高准确性。
4. 保存contig序列。
5. 重复：
以4中的contig为探针，重复步骤2，3，4。
直到不能在延伸为止。
（二）基于UNIGENE的电子克隆
1. 确定探针序列 （1）以已知物种的基因序列为探针，这个基因
核酸序列分析实例：
电子克隆及序列分析
王兴平
内容

什么是电子克隆
拼图游戏一样的原理


应用
操作过程


优点与缺点的讨论
现状与展望
什么是电子克隆
Watson & Crick 成功解析了DNA分子二级 结构，开创了分子生物学时代 Karry Mullis 发明了PCR反应，体外大规 模、有目的和快速地克隆目标基因成为可 能 信息科学技术特别是数据库技术在战后飞 速发展


什么是电子克隆

电子克隆技术是生物学数据库中EST数据库、核
酸序列数据库、基因组数据库，采用同源性序列 比对和归类分析、重叠区域组装和拼接等方法延 长EST序列，直至没有与之同源的序列可供拼接 为止，所得到的序列可以认为是相对应基因的全
长cDNA，根据所得的cDNA序列设计囊括开放阅
读框两端的引物，进行RT-PCR克隆出相应基因
拼图游戏一样的原理

借助计算机找到具有相同或相似图案的图块，拼 成完整的图案，我们需要做的是进行局部的微调。 剩下的工作就是对拼接出的cDNA进行可能的开 放阅读框的分析，设计囊括开放阅读框两端的引 物，RT-PCR扩增侯选基因
应用

电子克隆主要应用于两个方面：
一个是利用EST序列检索同源性序列，并由此拼
10.外显子/内含子切割位点分析
11.启动子预测: http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html
Байду номын сангаас
12.启动子区和转录因子结合位点: http://bioportal.bic.nus.edu.sg/tres/
13.Cpg岛预测: http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/index.html

分析与之相关的调控序列
如何做拼图游戏

基于EST的电子克隆 基于Unigene的电子克隆

（一）基于EST的电子克隆
1. 确定探针序列(电子克隆的基因)
（1）以已知物种的基因序列为探针，这个基因
可能在这个物种上没有被测序。
（2）已已经测序得到的一段EST为探针。
如:以小鼠Alox12 mRNA为探针,电子克隆牛的Alox12基 因
电子克隆序列的序列分析
1. 鉴定电子克隆的准确性：序列同源性比对（不同 物种多序列比对）
2. 进化树构建: DNAMAN; CLUSTAL-W软件 3. 碱基含量分析: DNASTAR6.0 EDITSEQ 4. 限制性酶切位点分析 http://www.restrictionmapper.org
现状与展望


国外的科研人员做了许多有益的贡献，特别是水 稻、拟南芥等全基因组测序完成后，借助软件分 析，从中发现和克隆了一系列全新的基因 我国的研究人员也进行不少的具有建设性和创造 性的探索和尝试，也取得了令人鼓舞的成果
现状与展望


随着科学技术的不断发展，以及数据库准确性的 逐渐提高，电子克隆的两大制约因素，辅助设计 软件和数据库将日臻完善，电子克隆技术将日趋 成熟。 电子克隆技术有可能从根本上改变人们对与基因 克隆的看法，改变基因克隆长久以来沿用的策略， 改变科研人员关注焦点，促使研究人员致力与生 物大分子的功能，以更好的造福于全人类


与传统的基因克隆方法相比，电子克隆有以下的 优点： 简便快速，成本低廉，设备简单 对操作人员技术要求不高 成功率高
优点与缺点的讨论



尽管电子克隆在理论上已没有什么障碍，然而在 实际操作中依然存在些不足之处： 电子克隆得到的cDNA序列是由计算机虚拟出来 的，现实中可能并不存在 研究人员不可完全迷信软件提供的结果，最好对 分析做人工可靠性验证 普遍适用性较差 电子克隆后需要研究其指导合成的蛋白质的功能 才更有实际意义
的方法
什么是电子克隆

传统的克隆方法是利用基因特异性引物大量扩增 cDNA末端或构建cDNA文库并采用原位杂交进行 筛选，实验进程长、步骤繁琐、成本高、得率低； 运用电子克隆的方法延伸得到的cDNA几乎囊括 了所有疑似为目的基因的cDNA序列，无论表达 转录如何调控，都能通过PCR扩增出表达的那一 段基因

什么是电子克隆

表达序列标签（expressed sequence tags，EST） 是对某个基因cDNA克隆测序所得的部分序列片 段，长度大约为200~600bp 由于基因表达调控作用不同，同一个基因的 mRNA剪接位点和方式不同，所以同一个基因的 全长cDNA可能包含多个EST
EST既代表了基因cDNA的某一区段，也表征了成 熟mRNA可能的剪接方式