聚谷氨酸发酵生产

课程设计说明书不同分子量聚谷氨酸制备条件研究
学院（系）
年级专业：
学号：
学生姓名：
指导教师：
教师职称：
2013-2014 春季学期
生物工程专业课程设计
结题论文
不同分子量聚谷氨酸制备条件研究
学院（系）：
年级专业：
学号：
学生姓名：
指导教师：
教师职称：
摘要
.
γ-PGA 是一种有极大开发价值和前景的多功能性生物制品，近年来被作为增稠剂，保湿剂，药物载体等而一直被广泛应用于工业领域。

它是一种水溶性和可生物降解的新型生物高分子材料，可通过微生物合成。

在生产低聚谷氨酸工艺当中，利用微生物发酵法生产聚谷氨酸具有很好的前景，但在利用微生物发酵法制备产物时，生产的聚谷氨酸具有较大的分子量，需要对其进行进一步的降解处理。

本设计拟对微生物发酵生产的高分子量的聚谷氨酸进行降解，并优化其降解条件，从而得到不同分子量的低聚谷氨酸分子，并利用琼脂糖凝胶电泳和高效液相凝胶色谱检测其降解后的分子量，从而确定最佳降解条件。

本设计主要分为三个部分对不同分子量的γ-PGA 的制备情况进行了研究。

第一部分是通过微生物发酵，提取得到 80-100 万分子量的大分子聚谷氨酸产物的设计；第二部分根据聚谷氨酸分子特性，设计筛选可降解大分子聚谷氨酸的方法，并优化降解条件，得到不同分子量的低聚谷氨酸分子，并找到合适的方法进行分离纯化；第三部分是在前两部分的基础上，通过建立琼脂糖凝胶电泳和液相凝胶色谱检测不同分子量低聚谷氨酸的方法，从而设计出最佳的制备条件。

关键词：生物发酵法、聚谷氨酸、降解条件、检测方法
目录
第一部分文献综述 (3)
1.1 γ-聚谷氨酸简介 (3)
1.2 聚谷氨酸结构 (3)
1.3 聚谷氨酸性质： (4)
1.3.1 吸水特性 (4)
1.3.2 生物可降解性 (5)
1.3.3 γ-PGA 的水解特性 (5)
2. γ-PGA 的应用前景 (5)
2.1 γ-PGA 的应用 (5)
2.1.1 聚γ-PGA 是一种微生物絮凝剂 (6)
2.1.2 γ-PGA作为一种新型的高分子吸水性材料 (6)
2.1.3 γ-PGA作为新型的药物载体 (6)
3. γ-PGA 合成方法 (7)
3.1 化学法合成 (7)
3.1.1 传统的肽合成法 (7)
3.1.2 二聚体缩聚法 (7)
3.2 提取法合成 (8)
3.3 微生物生物合成法 (8)
3.3.1 代谢途径 (8)
4. 研究进展 (8)
5. 总结——本设计的前景分析以及研究意义 (9)
5.1 前景分析 (9)
5.2 研究意义 (10)
1.材料 (12)
1.1 实验原料和试剂 (12)
1.2实验器材 (12)
2. 方法 (13)
2.1 微生物培养方法 (13)
2.1.1 平板培养 (13)
2.1.2 种子培养 (13)
2.1.3 摇瓶发酵 (13)
2.2 γ-PGA的纯化方法 (13)
2.2.1 菌体的分离 (13)
2.2.2 乙醇沉淀 (13)
2.2.3 丙酮分级沉淀 (13)
2.2.4 透析袋透析除盐 (13)
2.2.5 硅胶薄层层析 (14)
2.3 生理指标的测定方法 (14)
2.3.1 生物量测定 (14)
2.3.2 细胞数测定 (14)
2.3.3 分子量分析 (14)
2.3.4 粘度的测定 (15)
2.3.5 pH 稳定性的测定 (15)
2.4 碳源试验 (15)
2.5 氮源试验 (15)
2.6 前体物质L-谷氨酸试验 (16)
2.7 碳源、氨源、前体物质正交试验 (16)
2.8 无机离子正交试验 (16)
3 .1培养基营养成分对聚谷氨酸分子量影响的设计 (16)
3.1.1 培养基中不同碳源对聚谷氨酸分子量影响的设计 (16)
3.1.2 培养基中不同氮源对聚谷氨酸分子量影响的设计 (17)
3.1.3 培养基中前体谷氨酸对聚谷氨酸分子量影响的设计 (17)
3.2 培养基中碳源、氨源、前体物质正交试验的设计 (17)
3.3 不同pH 对不同分子量聚谷氨酸影响的设计分析 (17)
4. 设计分析 (17)
4.1 培养基营养成分对聚谷氨酸分子量影响的设计 (17)
4.1.1 碳源对产物Γ-PGA分子量合成的影响的设计分析 (17)
4.1.2 培养基中不同氮源对聚谷氨酸分子量影响的设计分析 (18)
4.1.3 培养基中前体谷氨酸对聚谷氨酸分子量影响的设计 (18)
4.2 培养基中碳源、氨源、前体物质正交试验的设计 (18)
4.3 不同pH 对不同分子量聚谷氨酸影响的设计分析 (18)
5 总结体会 (19)
参考文献 (21)
第一部分文献综述
1.概况背景
1.1 γ-聚谷氨酸简介
γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种由微生物生物合成的聚谷氨酸，它由 D-谷氨酸单体或L-谷氨酸单体以羧基和氨基相缩合而成[1]。

在生物体内γ-PGA 生物相容性良好，可以降解为谷氨酸而直接被生物体吸收，对于用作生物医用材料有明显优点。

另外，主链上有大量游离羧基存在，使γ-PGA 具有水溶性聚羧酸的性质，如强吸水和保湿性能，可用于化妆品、食品、分散剂、螯合剂、建筑涂料、防尘等领域[2-3]。

这些活性位点为材料的功能化提供了条件。

由于其良好的环境友好性，在注重环保强调可持续发展的今天，这种来自生物的可降解型功能材料受到人们的青睐。

1.2 聚谷氨酸结构
对γ-PGA 的氨基酸组分分析表明，该物质只有谷氮酸一种氨基酸组成，其纯化样品在 216 nm 处有吸收峰，与典型蛋白质吸收峰不同。

γ-PGA 经硅胶层析后，用不同官能团显色剂处理，α—萘酚、间苯二酚、甲基苯二酚反应呈阴性，双缩脲反应阴性而茚三酮反应阳性，该物质没有典型的肽链结构，也不是一种环状多肽。

随着温度的提高，γ-PGA 水溶液在一定的温度范围内粘度变化不大，聚合物结构较稳定。

在高温下，粘度下降快．γ-PGA 水解也很快，分子量逐渐变小，γ-PGA 的水解是由链的随机切割引起的。

不同生产方式得到的γ-PGA 的分子量有差异，如采用地衣芽孢杆菌摇瓶发酵得到的γ-PGA 的分子量为1.06 × 105 Da，而通过 5 L 发酵罐生产的γ-PGA 的分子量为 2.47 × 105 Da。

γ-PGA 的等电点为 3.47，它是一种酸性氮基酸聚合物。

1.3 聚谷氨酸性质：
1.3.1 吸水特性
由于γ-PGA 极易溶于水，因此其具有很好的吸水特性，王传海等对γ-PGA的吸水性能进行了研究，结果表明，γ-PGA 的最大自然吸水倍数可达到 1108 倍，比目前市售的聚丙烯酸盐类吸水树脂高 1 倍以上，对土壤水分的吸收倍数为 30-80 倍。

γ-PGA 的水浸液在土壤中具有一定的保水力和较理想的释放效果，有明显的抗旱促苗效应。

在0.206 mol / L浓度的 PEG(6000)模拟渗透胁迫条件下，γ-PGA 仍有较强的吸水和保水能力，可明显提高小麦和黑麦草的发芽率，用其直接拌种也能显著提高种子的发芽率[5]。

γ-PGA 的吸水性和保水性可使γ-PGA 被广泛应用于干旱地区保水以及沙漠绿化。

1.3.2 生物可降解性
生物可降解性是γ-PGA 的特性之一。

所有γ-PGA 产生菌株都可以以γ-PGA 作为营养源进行生长。

在培养液中存在一种与γ-PGA 降解有关的解聚酶。

其它自然菌株也具有降解γ-PGA 的能力。

以γ-PGA 作为唯一碳源和氮源对可降解γ-PGA 的菌株进行筛选，结果筛选出至少 12 株可降解γ-PGA 的菌株[6]。

由此可知，发酵生产γ-PGA 的培养时间对产量有较大的影响，时间过长会导致γ-PGA 分子被酶解而损失。

1.3.3 γ-PGA 的水解特性
γ-PGA 的水溶液在 10 mL、浓度为 6 mol / L的 HCl 中，抽真空封口，105 ℃ 的烘箱的条件下可以水解为谷氨酸，吕莹等[7]的研究表明，水解 17 h、25 h、48 h的结果一致。

此特性可用于γ-PGA 纯度的测定。

2. γ-PGA 的应用前景
2.1 γ-PGA 的应用
γ-PGA是一种天然存在的水溶性的聚合氨基酸，具有生物可降解性，可食用且对人体和环境无毒害。

近年来其被作为生物絮凝剂，增稠剂，加湿剂，药物载体，药物缓释剂，生物可降解纤维，高吸水性树脂，重金属吸收剂以及食品添加剂等一直被广泛应用于工业领域如食品工业，药物工业，化妆品工业
及污水处理中，是一种有极大开发价值和前景的多功能新型生物制品。

2.1.1 聚γ-PGA 是一种微生物絮凝剂
γ-PGA可以用作饮用水、废水、发酵食品工业下游过程溶液的生物絮凝剂以及重金属或放射性物质螯合剂，用于回收金属盒减少环境污染等。

2.1.2 γ-PGA作为一种新型的高分子吸水性材料
近年来，人们把水溶性高分子作为精细化工的骨干产品之一，越来越受到人们的重视。

它的应用范围几乎涉及人所能涉及的任何领域。

随着高分子材料的快速发展，在其重要性日益突现的同时，人们发现了它的不足之处，即大部分的人工合成的高分子材料在自然界难以降解。

在人们越来越关心自己生存环境的今天，不可降解的高分子材料造成的“白色污染” (如聚乙烯、聚丙烯等)，也越来越受到人们的关注。

为了解决这个问题，人们开展了各种研究工作。

制成了各种可生物降解材料[8]。

在日本，聚谷氨酸得到广泛应用，主要以谷氨酸γ-甲基酯为基础，生产新型聚合物IITC。

此类聚合物可以用来制造皮革、纤维、食品包装膜等。

聚合 D-谷氨酸用苯乙烯改性后，可得到高抗碱性的纤维树脂。

若通过改性再聚合，可得到比一般天然纤维和化学纤维更优的材料，如外科手术的缝合线，就是以氨基酸和羧酸为基础，由易水解纤维状和薄膜状的聚合物制得的。

而渗透杀菌剂、防腐剂、抗生素的聚合氢基酸对伤口和皮肤病还有防治作用。

以谷氨酸和烷基谷氨酸酯的共聚物为基础，研制出来的聚合物是药品很好的包裹材料，可作胶囊或糖衣片。

日本九州大学原敏夫等人通过大豆发酵，提取γ-PGA，用电子柬照射，制成γ-PGA 树脂，这种物质呈白色粉末状，具有极强的吸水性，其吸水性能是纸和尿不湿的 5 倍。

γ-PGA 吸水饱和后，呈凝胶状，可包裹在植物种子的表面上作为种子的理想包衣材料。

原敏夫认为，这种树脂是沙漠绿化的好武器，并提出了中国绿化沙漠的设想(原敏夫特开平)。

另外，γ-PGA 作为一种凝胶材料，也可以起分子筛作用
2.1.3 γ-PGA作为新型的药物载体
γ-PGA 具有良好的生物亲和性和生物降解性，作为药物载体可提供药物缓释性、靶向性，提高药物水溶性，降低药物不良反应，从而提高药物疗效。

（1）用作金属螫合物抗癌药物顺二氯二氨铂(CDDP)的载体
该药物为重金属络合物，微溶于水，且在水中不稳定，疗效低，对细胞毒性大，用γ-PGA (相对分子量 4 × 104)作为药物载体，可形成有活性的、相对稳定的 CDDP-PGA 复合物，该复台物有较高的动力学稳定性和对正常细胞较低的毒性，有利于 Pt2+ 对配体的亲和，而且其治疗剂量范围宽。

（2）作为水不溶性植物类化疗药物的载体
化疗药物大多难溶或不溶于水，细胞毒性大，选择性小。

如喜树碱难溶于水，而且它的内酯形式不稳定，导致使用受限制，疗效低。

但10-羟 CPT 或9-氨基 CPT 与 PGA 偶联形成 CPT-PGA 复合物后，水溶性大为增加。

复合物对同源的和异源的肿瘤都保持较高的抗肿瘤活性。

（3）用作抗生素类抗癌药物阿霉素的载体，可明显地提高疗效。

（4）γ-PGA 的半乳糖或甘露糖酯化衍生物可作为肝细胞特殊药物的载体，通过糖酯化的 PGA 的结合作用把相对分子量低的药物运送到肝细胞中，起到了靶向作用。

（5）γ-PGA与明胶有较好的兼容性，适合制作外科及手术用的可生物降解的粘胶剂、止血剂及密封剂[10]。

3. γ-PGA 合成方法
3.1 化学法合成
3.1.1 传统的肽合成法
传统的肽合成法是将氨基酸逐个连接形成多肽，这个过程一般包括基团保护、反应物活化、偶联和脱保护。

化学合成法是肽类合成的重要方法，但合成路线长、副产物多、收率低，尤其是含 20 个氨基酸以上的纯多肽合成
3.1.2 二聚体缩聚法
由L –Glu、D-Glu 及消旋体（D，L –Glu）反应生成α-甲基谷氨酸，后者凝聚成谷氨酸二聚体后，再与浓缩剂 1，3-二甲氨丙基-3-乙基碳亚二胺盐酸盐及 1-羟苯基三吡咯水合物在 N，N-二甲基甲酰胺中发生凝聚，获得产率为 44 % ~ 91 %、相对分子质量为 5000 ~20000 的聚谷氨酸甲基酯，经碱性水解变成γ-PGA。

化学合成法难度很大，没有工业应用价值。

3.2 提取法合成
早期，日本生产γ-PGA大多采用提取法，用乙醇将纳豆（一种日本的传统食品）中的γ-PGA 分离提取出来。

由于纳豆中所含的γ-PGA 浓度甚微，且有波动，因此提取工艺十分复杂，生产成本甚高，同样难以大规模生产。

3.3 微生物生物合成法
迄今为止的发酵生产仍处于试验室阶段，小试生产方法归纳起来主要有分批发酵法、连续发酵法、液体两相发酵法、搅拌罐反应器自循环发酵法、固体发酵法和固定化酶法等 6 种，分批发酵法简单方便，容易操作和控制，因此在实验室研究中用的较为广泛。

3.3.1 代谢途径
自从1942 年 Bovarnick 等发现芽孢杆菌属微生物能在培养基中蓄积γ-PGA以来，利用微生物生物聚合生成γ-PGA 的研究十分活跃。

人们对不同的微生物进行了代谢途径分析，由于分析手段和其他人为原因的限制，以致现在γ-PGA 的代谢途径仍然是一个黑箱模型。

4. 研究进展
由于γ-PGA 具有环境友好等特性使其应用日益广泛，对其研究越来越多，然而目前国内主要是对γ-PGA 生产方面尤其是菌种及发酵条件的研究，而且大多数发酵生产仍处于试验室阶段，实现其产业化还有一定距离。

国外对其应用研究则比较多，尤其是在附加值比较高的医药领域。

在今后研究中，一
方面是在提高γ-PGA 产量同时建立一种生产成本低廉、生产工艺简单、生产条件温和的工艺，为大规模生产奠定基础：另一方面是不断扩大应用研究的广度和深度，同时进行创新性研究
[12]。

5. 总结——本设计的前景分析以及研究意义
5.1 前景分析
近年国内强大的需求释放与巨大的产能缺口，是化工新材料被广泛看好的最重要的理由。

新材料技术是 21 世纪三大关键技术之一，是发展信息、航天、能源、生物等高新技术的重要物质基础已成为全球经济增长的源动力和各国提升核心竞争力的焦点。

包括新的功能聚合物、复合材料、高性能化的通用塑料新品种、可降解塑料、纳米材料等。

与传统化工材料相比。

它们具有优异性能或特殊功能．对国民经济特别是高技术领域及尖端技术有重要作用。

长期以来，新材料产品及其原料对外依存度较高，一些高端品种甚至完全依赖进口。

而近年来．国内龙头企业通过不断研发和创新，形成了具有自主知识产权的工艺和技术，逐渐具有成本和规模优势，替代进口前景广阔。

我国政府对新材料行业在各个层次上都有扶持性政策。

在前瞻性研究方面，国家计划每年对新材料项目援助在3.5亿元左右：在产业项目方面，有火炬计划、中小企业创新基金、国家科技攻关计划等每年通过拨款和贴息贷款等形式给予资助；按照国家政策的精神．各地各级政府也都给予新材料企业出口补贴和税收优惠。

这些政策的实施使中国新材料科技水平大大提高．同时引导大量的社会资金向新材料领域投资，促进了新材料科技成果转化，推动了新材料产业的发展。

市场发展需要和国家政策导向都使得绿色生物环保材料企业的投资风险降到比较低的水平[13]。

我国氨基酸行业的主要竞争对手是日本，多年来与日本既竞争又合作。

前些年，在我国不能生产原料时，对方输入原料，同时输入生产技术。

现在我们可以生产氨基酸原料，对方则进行精加工。

所以国内企业在产品精加工方面应该重视，不应仅停留在生产粗原料上。

国内原料企业应严格执行内控标准，改粗品生产为精品生产，变粗品出口为精品出口，以精品占领国际市场，获取更大利润。

如若实现聚谷氨酸以谷氨酸为底物的大规模发酵生产，将为我国的氨
基酸产业的发展开拓广阔的国际生存空间。

随着分子生物学新技术的应用，利用基因工程方法构建聚谷氨酸工程菌将从根本上解除制约聚谷氨酸生产的瓶颈问题，为氨基酸发酵行业的进一步发展奠定坚实的基础
[14]。

5.2 研究意义
高分子材料是分子量高达数万至数百万的巨大“高分子”聚合而成的材料，具有许多优异性能．以及生产、应用的投资比其他材料低．在许多领域得到广泛应用。

尤其到了上世纪80年代．工业发达国家的钢铁产量已经出现了衰退，而塑料仍以高速度在发展，如美国在过去的40年里的塑料产量猛增了100倍。

但是，合成高分子材料在21世纪面临了严重的挑战，主要来自三个方面：首先，合成高分子材料的性能还需改进；其次，合成高分子材料的循环使用和生物降解性差，随着大量高分子材料在各个领域的使用，废弃物对环境的污染有着日益加剧的趋势，如废塑料所造成的“白色污染”已成为世界性的公害；再次，合成高分子材料的主要原料-石油是不可再生资源，其储量越来越少，随着国内外“白色污染”日益严重和能源危机的出现，可持续发展的环境友好高分子材料的开发逐渐得到世界各国的重视，因而降解性高分子材料成为21世纪最具发展前景的高分子材料。

世界工业的一大新趋向是开发“绿色化学产品”（即对环境无害的化工产品）。

聚合氨基酸系列产品已在“绿色化学产品”中崭露头角。

日本是世界上最大氨基酸生产国与输出国，日本科学家在聚合氨基酸的研究开发已领先于世界。

近年来国外研究日趋热门，而国内少有相关的研究报道[15]，中国在这方面的研究尚处于起步阶段，只有少数科研单位进行聚氨基酸的研究和开发，如聚谷氨酸高吸水性树脂、聚谷氨酸-表阿霉素偶合物等，但研究的深度、广度等均与国外有较大的差距，研究工作仅限于实验室，离产业化有较大的距离，因此建立完整、系统、大规模的聚谷氨酸微生物生产方法是今后亟待解决的课题之一。

第二部分课程设计部分
不同分子量聚谷氨酸制备条件研究
微生物合成的γ-PGA 是一种水溶性的可生物降解的生物高分子，相对分子质量在 1 万-100万，个别能达到 200 万。

它完全无毒害作用，甚至可以直接食用。

聚谷氨酸及其衍生物可广泛的应用在食品工业、化妆品、保健、水处理、废水处理、卫生用品、医疗以及水凝胶等领域，而区别其应用领域的主要指标则是γ-PGA 的分子量。

按照其应用领域所需要的分子量大小的差异，可以将γ-PGA 分成四个级别，分别是：肥料级，0.5-1 万单位；食品级，10-70 万单位；化妆品级，70-110 万单位；药品级，120-200 万单位。

由于发酵法生产的γ-PGA 相对分子质量比较大，可以通过酸水解将其降解为不同相对分子质量的γ-PGA，由于其降解分子量的不同，可以用于不同的行业，可大大推进其工业化生产与市场化应用之间的联系。

1.材料
1.1 实验原料和试剂
牛肉膏柠檬酸
蛋白胨甘油
硅胶磷酸二氢钠
SDS-分子量标准蛋白蒸馏水
氯化钠L-谷氨酸
琼脂盐酸
1.2实验器材
722分光光度计上海第三分析仪器厂
pH计北京屺源电子设备仪器公司
电泳仪中国上海沪西分析仪器厂
冷冻干燥机军事医学科学院仪器公司
TGLl6C离心机上海安亭科学仪器厂
薄层层析设备北京化学试剂公司
超净工作台哈尔滨东联电子设备有限公司
恒温水浴锅北京医疗设备厂
电热恒温培养箱湖北黄石医疗仪器厂
电热式压力蒸汽消毒器上海博迅设备厂
电热恒温水浴锅吴江宏成电热设备有限公司
SNB-1 型旋转式粘度剂上海精密仪器有限公司
2. 方法
2.1 微生物培养方法
2.1.1 平板培养
取富集培养液 1 ml，采用十倍梯度稀释方法涂布于装有选择性培养基的平板上，之后37 "C 培养箱培养24 h。

2.1.2 种子培养
从保藏斜面上取一至两环菌接入种子培养基中，于37 "C、150 r / min 下摇床培养 24 h。

2.1.3 摇瓶发酵
发酵以 2 ﹪的接种量将种子液接入发酵培养基(50 mL / 300 mL 锥形瓶)中．于37 ℃、150 r / min 下摇床培养 96 h。

2.2 γ-PGA的纯化方法
2.2.1 菌体的分离
将发酵液在 12000 rpm 条件下离心30 min，取上清液备用。

2.2.2 乙醇沉淀
将上清夜加入 4 倍体积的乙醇，搅动后置于低温过夜，12000 rpm，30 min 离心收集沉淀物用去离子水洗涤沉淀物 2 次合并上清夜，再用 4 倍体积乙醇沉淀，12000 rpm，30 min 离心，反复三次，收集沉淀物[17]。

2.2.3 丙酮分级沉淀
将乙醇沉淀后的粗样品溶解在 0.015 mol / L，pH 6.98 的磷酸氢二钠、磷酸二氢钾缓冲溶液中，加入 4 倍体积预冷的丙酮，12000 rpm 离心 30 min，分离沉淀，在上清夜中继续加入原体积 8 倍的预冷丙酮，12000 rpm 离心 30 min，收集沉淀。

2.2.4 透析袋透析除盐
把丙酮分级沉淀提取得到的沉淀物倒入截留分子量 8000～12000 的透析袋内，在电磁搅拌器上 4 ℃ 进行透析 40 min，其间 10 分钟换水一次。

在此之后，将透析袋中的沉淀物冷冻干燥。

2.3 生理指标的测定方法
按照正交实验设计的条件，将高分子的γ－PGA 降解为低分子的聚谷氨酸，之后经膜过滤截留得到分子量为 10000~100000 的低聚谷氨酸。

其中膜过滤过程中所使用的膜型号为 PS10，截留分子量为 10000，为内压式；PP100，
截留分子量为 100000，为外压式，膜材料均为中空纤维，工作时控制压力在0.1 MPa 以下。

使用前先用 0.2% 的 NaOH 溶液清洗，再用自来水、蒸馏水清洗方可进行截留。

2.3.1 降解程度检测
将降解后的小分子聚谷氨酸配制成浓度为 20 mg/mL 的溶液 2 mL，之后用琼脂糖凝胶电泳测定分子量。

所用的标准蛋白分子量依次为 14.4 KDa，20.2 KDa，26.0 KDa，35.0 KDa，45.0 KDa，66.2 KDa，94.0 KDa。

具体操作如下：
（1）制备琼脂糖凝胶
制备 1﹪琼脂糖凝胶：称取 0.7 g 琼脂糖置于锥形瓶中，加入 70 mL 1× TAE，瓶口倒扣小烧杯。

微波炉加热煮沸 3 次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成 1﹪琼脂糖凝胶液。

胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽洗干净、晾干，放入制胶玻璃板。

取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。

将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。

将冷却到 65 ℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。

室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。

(2) 制备样品和上样
样品的处理：γ-PGA 样品（浓度约为 20 mg/mL）与样品缓冲液按 1:1 的比例混合，在 100 ℃水浴处理 2~5 min，Marker 的处理方法相同。

用移液枪将样品加入样品孔中，上样量为15 μL。

将蛋白质样品加至样品孔的底部，并随着染料水平的升高而升高移液枪枪头。

避免带入气泡，气泡易使样品混入到相邻的加样孔中。

电泳条件：电压为 75 V，电流一般为50 mA，电泳至溴酚兰接近胶边缘，结束电泳。

(3) 确定分子质量
2.3.4 粘度的测定
取经纯化后的γ-PGA．用蒸馏水按 0 g / L、0.3 g / L、0.6 g / L、0.9 g / L、1.2 g / L、1.5 g / L、2 g / L 的浓度成不同梯度稀释，调节pH值为7，用 SNB—1 数字型粘度计，25 "C，3号转子，12 r / min 测定。

2.3.5 pH 稳定性的测定
取经纯化后的γ-PGA，用超纯水配制成一定浓度的γ-PGA 溶液，分别调节不同的pH值观察粘度变化。

3. 实验设计
3.1 通过微生物发酵、提取得到80-100 万分子量的聚谷氨酸产物的设计
3 .2 单因素实验确定γ-PGA 降解工艺参数范围的设计
3.2.1 温度对γ-PGA 降解效果的影响
通过翻阅相关文献，在用酸水解γ-PGA 时，温度越高，使得提供给肽键断裂能量就越多，随机断裂肽链越频繁，降解效果越好。

通过选择不同的温度梯度，并且控制单一条件变量，从而考察在 pH 值为 7 的条件下水解 8 h，聚谷氨酸在不同温度 60，80，100 ℃下，对γ-PGA 降解效果的影响，记录数据。

3.2.2 pH 值对γ-PGA 降解效果的影响
通过查阅相关文献，可以知道不同 pH 值条件下γ-PGA 降解趋势相差很大。

选择不同的 pH 值在 3，7，11，于以上最佳温度培养下水解 8 h，以考察不同 pH 值对γ-PGA 降解效果的影响，记录数据，并做成图表。

3.2.3反应时间对γ-PGA 降解效果的影响
通过以上条件的设计，选择出最佳的温度以及 pH，并在此条件下分别水解 4，8，12 h，以考察不同反应时间对γ-PGA 降解效果的影响，记录数据，并做成图表。