聚谷氨酸发酵生产

课程设计说明书不同分子量聚谷氨酸制备条件研究

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2013-2014 春季学期

生物工程专业课程设计

结题论文

不同分子量聚谷氨酸制备条件研究

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摘要

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γ-PGA 是一种有极大开发价值和前景的多功能性生物制品，近年来被作为增稠剂，保湿剂，药物载体等而一直被广泛应用于工业领域。它是一种水溶性和可生物降解的新型生物高分子材料，可通过微生物合成。在生产低聚谷氨酸工艺当中，利用微生物发酵法生产聚谷氨酸具有很好的前景，但在利用微生物发酵法制备产物时，生产的聚谷氨酸具有较大的分子量，需要对其进行进一步的降解处理。本设计拟对微生物发酵生产的高分子量的聚谷氨酸进行降解，并优化其降解条件，从而得到不同分子量的低聚谷氨酸分子，并利用琼脂糖凝胶电泳和高效液相凝胶色谱检测其降解后的分子量，从而确定最佳降解条件。本设计主要分为三个部分对不同分子量的γ-PGA 的制备情况进行了研究。第一部分是通过微生物发酵，提取得到 80-100 万分子量的大分子聚谷氨酸产物的设计；第二部分根据聚谷氨酸分子特性，设计筛选可降解大分子聚谷氨酸的方法，并优化降解条件，得到不同分子量的低聚谷氨酸分子，并找到合适的方法进行分离纯化；第三部分是在前两部分的基础上，通过建立琼脂糖凝胶电泳和液相凝胶色谱检测不同分子量低聚谷氨酸的方法，从而设计出最佳的制备条件。

关键词：生物发酵法、聚谷氨酸、降解条件、检测方法

目录

第一部分文献综述 (3)

1.1 γ-聚谷氨酸简介 (3)

1.2 聚谷氨酸结构 (3)

1.3 聚谷氨酸性质： (4)

1.3.1 吸水特性 (4)

1.3.2 生物可降解性 (5)

1.3.3 γ-PGA 的水解特性 (5)

2. γ-PGA 的应用前景 (5)

2.1 γ-PGA 的应用 (5)

2.1.1 聚γ-PGA 是一种微生物絮凝剂 (6)

2.1.2 γ-PGA作为一种新型的高分子吸水性材料 (6)

2.1.3 γ-PGA作为新型的药物载体 (6)

3. γ-PGA 合成方法 (7)

3.1 化学法合成 (7)

3.1.1 传统的肽合成法 (7)

3.1.2 二聚体缩聚法 (7)

3.2 提取法合成 (8)

3.3 微生物生物合成法 (8)

3.3.1 代谢途径 (8)

4. 研究进展 (8)

5. 总结——本设计的前景分析以及研究意义 (9)

5.1 前景分析 (9)

5.2 研究意义 (10)

1.材料 (12)

1.1 实验原料和试剂 (12)

1.2实验器材 (12)

2. 方法 (13)

2.1 微生物培养方法 (13)

2.1.1 平板培养 (13)

2.1.2 种子培养 (13)

2.1.3 摇瓶发酵 (13)

2.2 γ-PGA的纯化方法 (13)

2.2.1 菌体的分离 (13)

2.2.2 乙醇沉淀 (13)

2.2.3 丙酮分级沉淀 (13)

2.2.4 透析袋透析除盐 (13)

2.2.5 硅胶薄层层析 (14)

2.3 生理指标的测定方法 (14)

2.3.1 生物量测定 (14)

2.3.2 细胞数测定 (14)

2.3.3 分子量分析 (14)

2.3.4 粘度的测定 (15)

2.3.5 pH 稳定性的测定 (15)

2.4 碳源试验 (15)

2.5 氮源试验 (15)

2.6 前体物质L-谷氨酸试验 (16)

2.7 碳源、氨源、前体物质正交试验 (16)

2.8 无机离子正交试验 (16)

3 .1培养基营养成分对聚谷氨酸分子量影响的设计 (16)

3.1.1 培养基中不同碳源对聚谷氨酸分子量影响的设计 (16)

3.1.2 培养基中不同氮源对聚谷氨酸分子量影响的设计 (17)

3.1.3 培养基中前体谷氨酸对聚谷氨酸分子量影响的设计 (17)

3.2 培养基中碳源、氨源、前体物质正交试验的设计 (17)

3.3 不同pH 对不同分子量聚谷氨酸影响的设计分析 (17)

4. 设计分析 (17)

4.1 培养基营养成分对聚谷氨酸分子量影响的设计 (17)

4.1.1 碳源对产物Γ-PGA分子量合成的影响的设计分析 (17)

4.1.2 培养基中不同氮源对聚谷氨酸分子量影响的设计分析 (18)

4.1.3 培养基中前体谷氨酸对聚谷氨酸分子量影响的设计 (18)

4.2 培养基中碳源、氨源、前体物质正交试验的设计 (18)

4.3 不同pH 对不同分子量聚谷氨酸影响的设计分析 (18)

5 总结体会 (19)

参考文献 (21)

第一部分文献综述

1.概况背景

1.1 γ-聚谷氨酸简介

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种由微生物生物合成的聚谷氨酸，它由 D-谷氨酸单体或L-谷氨酸单体以羧基和氨基相缩合而成[1]。在生物体内γ-PGA 生物相容性良好，可以降解为谷氨酸而直接被生物体吸收，对于用作生物医用材料有明显优点。另外，主链上有大量游离羧基存在，使γ-PGA 具有水溶性聚羧酸的性质，如强吸水和保湿性能，可用于化妆品、食品、分散剂、螯合剂、建筑涂料、防尘等领域[2-3]。这些活性位点为材料的功能化提供了条件。由于其良好的环境友好性，在注重环保强调可持续发展的今天，这种来自生物的可降解型功能材料受到人们的青睐。

1.2 聚谷氨酸结构

对γ-PGA 的氨基酸组分分析表明，该物质只有谷氮酸一种氨基酸组成，其纯化样品在 216 nm 处有吸收峰，与典型蛋白质吸收峰不同。γ-PGA 经硅胶层析后，用不同官能团显色剂处理，α—萘酚、间苯二酚、甲基苯二酚反应呈阴性，双缩脲反应阴性而茚三酮反应阳性，该物质没有典型的肽链结构，也不是一种环状多肽。随着温度的提高，γ-PGA 水溶液在一定的温度范围内粘度变化不大，聚合物结构较稳定。在高温下，粘度下降快．γ-PGA 水解也很快，分子量逐渐变小，γ-PGA 的水解是由链的随机切割引起的。不同生产方式得到的γ-PGA 的分子量有差异，如采用地衣芽孢杆菌摇瓶发酵得到的γ-PGA 的分子量为1.06 × 105 Da，而通过 5 L 发酵罐生产的γ-PGA 的分子量为 2.47 × 105 Da。γ-PGA 的等电点为 3.47，它是一种酸性氮基酸聚合物。

1.3 聚谷氨酸性质：