最新实验原理与方法2009

实验原理与方法蔬菜生理与生态实验室

南京农业大学园艺学院

二零零九年十月

目录

1、氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD）

2、POD（过氧化物酶）活性的测定——愈创木酚法

3、CAT(过氧化氢酶)测定

4、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定

5、谷胧甘肽还原酶(GR)的活力测定:

6、O2-产生速率的测定

7、过氧化氢(H2O2)含量的测定——碘化钾分光光度法

8、丙二醛（MDA）含量的测定

9、还原型抗坏血酸（ASA）和脱氢抗坏血酸（DHA）的测定

10、谷胱甘肽还原酶测定

11、MDAR(单脱氢抗坏血酸还原酶)活性的测定

12、可溶性总糖的测定

13、考马斯亮蓝G-250染色法测定可溶性蛋白含量

14、叶绿素含量的测定

15、石蜡制片的制作

16、激素Indole-3-Acetic Acid（IAA）、Abscisic Acid（ABA）、GA3和ZA的测定

17、cDNA扩增片段长度多态性技术（cDNA-AFLP）

18、3′/5′RACE 扩增基因全长

19、根系活力的测定（TTC法）

一氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD）

【实验原理】

SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：Mn－SOD和Cu.Zn－SOD，它们都催化下列反应：

由于超氧自由基（O2.－）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2.－，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替（黄色），继而还原生成二甲月替，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm 波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比。反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低。

【仪器、材料与试剂】

（一）仪器

1. 分光光度计

2. 台式离心机

（二）材料

1. 磷酸氢二钠

2. 磷酸二氢钠

3. 甲硫氨酸

4. EDTA-Na2

5. 核黄素

6. 氮蓝四唑(NBT)

7. 陶瓷小研钵

8. 4-5ml 离心管

9. 10ml 玻璃试管

（三）试剂

1. 0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：

A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；

B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

2. 14.5mM甲硫氨酸溶液：称取1.0818g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至500ml。

3. 3mM EDTA-Na2溶液：称取0.1117g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。

4. 60μM核黄素溶液：称取0.0023g 核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

5. 2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：称取0.092g NBT用PBS定容至50ml，避光保存。【实验步骤】

1. 酶液提取

称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清夜即为SOD粗提液。

2. 酶活性测定

（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取配好的Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液6ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后充分摇匀；

（2）分别取3ml反应混合液和40μl（可视情况调整）酶液于指形管中此即反应管；同时做两支对照管，其中1支试管加3ml反应混合液和40μl PBS（不加酶液）作为最大光还原管，另1支加3ml反应混合液和40μl PBS同时用锡箔纸包好遮光用于测定时调零。

（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照25℃下反应20min；

（4）反应结束后以不照光的对照管调零，分别测定各管在560nm下的吸光度（OD560）

3. 计算结果

已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活单位（U），按下式计算活性

n=[(OD max-OD560)/OD max]/2

SOD总活性＝[( A ck-A E )×V]/（1/2A ck×W×Vt）

SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量

SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；

A ck为照光对照管的吸光度；A E为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时的酶液用量（ml）；W为样品鲜重（g）；蛋白质含量单位为mg/g。

【注意事项】

1. 酶液提取须在4℃下进行，提取后立即进行测定，冰箱中放几小时活性也会下降；

2. 植物中的酚类物质对测定有干扰，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或