血清碱性磷酸酶的活性测定
血清碱性磷酸酶活性测定
临床意义
• 在临床上，血清ALP测定常作为肝胆疾病和骨骼 疾病的临床辅助诊断指标。 • 1．血清 血清ALP活性升高 ： 肝胆疾病：阻塞性黄疸、 血清 活性升高 急性或慢性黄疸性肝炎、肝癌等；骨骼疾病：由 于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的 ALP释放进入血液中，引起血清ALP活性增高， 如纤维性骨炎、成骨不全症、佝偻病、骨软化病、 骨转移癌和骨折修复愈合期等。 • 2．血清 血清ALP活性降低 活性降低： 比较少见，主要见于呆 血清 活性降低 小病，ALP过少症，维生素C缺乏症。
血清碱性磷酸酶活性测定
磷酸苯二钠法
小组成员：
• 程展鹏，杨秋月，陈敬根， 程展鹏，杨秋月，陈敬根， 卢昆
实验目的
• 熟悉酶活性测定方法的一般原理 • 掌握血清ALP测定原理与临床意义
实验原理
• 在PH10 环境中，ALP催化磷酸苯二钠水解生成 苯酚和磷酸氢二钠，苯酚与4-氨基安替比林反应 生成色素原，该色素原经铁氰化钾氧化生成红色 醌亚衍生物。测定红色物质的吸光度就可以计算 酶活性的大小。 • 反应式如下： • ALP 磷酸苯二钠+H2O——苯酚+磷酸氢二钠 • pH10 • 铁氰化钾 苯酚+4-氨基安替比林————红色醌亚胺衍生物
注意事项
• 1．底物溶液中不应含有游离酚，如有酚则 空白管显红色，说明磷酸苯二钠已经开始 分解，应弃去不用。 • 2．铁氰化钾溶液中加入硼酸有稳定显色作 用。该液应避光保存，如出现蓝绿色即应 废弃。 • 3．加入铁氰化钾溶液后必须立即混匀，否 则显色不完全。
• 立即混匀。用510nm波长比色，以蒸馏水 调零点，读取各管吸光度。 • 计算 ALP活性=（A测定—A ）/（A —A ） *0.05*100(金氏单位）下： 取试管6支，分别加酚标准液 (1ml=0．1mg)，0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4ml， 各管依次加复合基质液3.1、3.05、3.0、2.9、2.8、 2.7ml。混匀后37℃水浴保温5分钟，各管加入 1.0ml碱性溶液，再加0.5％铁氰化钾2.0ml，立即 混匀。静置10分钟，510nm波长下比色。将以上 各管所得读数与其相应的碱性磷酸酶单位(依次为 0.5、10、20、30、40单位)在坐标纸上作图，绘 制成标准曲线。
血清碱性磷酸酶磷酸对硝基苯酚法测定
血清碱性磷酸酶（ALP）磷酸对硝基苯酚法测定1.实验原理碱性磷酸酶的活性由在pH值为10.4，2-氨基-2甲基-1-丙醇（AMP）存在的情况下测量p-硝基-磷酸苯酯（pNPP）的转换速率决定。
ALPpNPP + AMP -----------﹥pNP+AMP-PO4在410/480nm测定pNP的生成速率，它与标本中ALP的活性成正比。
2. 标本采集与处理：2.1 病人准备：无特殊要求。
2.2 标本类型：标本最好是无溶血的血清或肝素化的血浆。
2.3 血清分离：应在收集后两小时内分离出来。
避免使用含EDTA或草酸盐的血浆。
3. 标本存放：2～3天内的活性损失：15～25℃保存：<10%；标本稳定性：4～8℃保存稳定7天；-20℃保存至少可稳定2个月标本。
如果分析延迟8小时以上，最好把血清冷藏。
冷冻的血清在融解后会表现出血清值的显著降低。
4. 标本运输：常温条件下运输5. 标本拒收标准：细菌污染的不能做测定。
6. 实验材料：6.1 上海申能ALP测定试剂盒（141 0417170 1 试剂1 6×64 ml ＋试剂2 6×16 ml）6.1.1 试剂组成试剂1：2-氨基-2甲基-1-丙醇（AMP）缓冲液0.90mol/L（pH:10.4）醋酸镁 1.6mmol/L硫酸锌0.4mmol/LHEDTA 2.0mmol/L试剂2：磷酸对硝基酚16.0mmol/L6.1.2 试剂准备：试剂为即用式。
6.1.3 试剂稳定性与贮存：原试剂避光保存于2～8℃，若无污染，可稳定至失效期。
试剂不可冰冻。
6.1.4 变质指示：当试剂有浊度时，表明有细菌污染，不能继续使用。
6.1.5 注意事项：碱性磷酸酶试剂中含叠氮钠，避免接触皮肤及粘膜。
反应过程中产生的对硝基苯酚有毒性，切勿吸入、吞食、接触皮肤或粘膜。
若反应液与皮肤或粘膜接触，请速用水冲洗。
6.2 校准品：使用DiaSys公司提供的TruCal U校准品对自动分析仪进行校准，具体参见生化检验校准品和质控品.SOP文件。
ALP测定
三、实验用品
半自动生化分析仪
ALP测定试剂盒；
刻度吸管
微量加样器
人血清
目录
四、实验过程 按 表 加 量
试剂 工作液 蒸馏水 样品 空白管 样品管 1.00mL 1.00 mL 0.02 mL — — 0.02 mL
混匀，在反应温度37°C保温60秒，入=405nm处使用半自动生 化分析仪测定和读取ALP值（U/L） 。 正常参考值 37℃下，20-50岁男性：53-128；60岁以上男性：56-119 20-50岁女性：42-98； 60岁以上女性：53-141
目录
六、实验注意事项
1.血清标本新鲜，避免溶血；
2.正确操作半自动生化分析仪；
3.注意试剂安全，避免直接接触皮肤和 眼睛，切勿吞咽。
目录
半自动生化分析仪的使用
目录
目录
半自动生化分析仪的使用
吸液键 吸液管
目录
ห้องสมุดไป่ตู้录
目录
目录
目录
目录
目录
目录
目录
目录
目录
ALP
对硝基苯酚(4-NP)
＋磷酸盐
4-NPP在碱性溶液中为无色，在ALP催化下， 4-NPP水解产生游离的4-NP。 4-NP在碱性溶液中 转变为黄色，在405nm下有最大吸收峰。 4-NP 形成的速率与血清中ALP的活性成正比，测定 405nm处吸光度增加速率（△A/min），即可计 算ALP的活性。
目录
五、实验结果与分析
1、实验结果 2、实验分析 3、临床意义 正常人血清中ALP主要来自肝脏和骨骼，所 以ALP常作为作为肝胆疾病和骨骼疾病的辅助 诊断指标。 血清ALP活性病理性增高可见于： （1）肝胆疾病 阻塞性黄疸、胆道梗阻等； （2）骨骼疾病 佝偻病、骨质软化病等。 血清ALP活性生理性增高见于妊娠期与儿童 生长发育期。
碱性磷酸酶活性测定
方法评价
优点：灵敏度较高，显色稳定，
不需去蛋白，操作简单、快速；
缺点：准确度和精密度都较低,受
胆红素和溶血的干扰。
实验材料与仪器
器材： 新鲜血清、移液器、试管及试管 架、吸量管、恒温水浴箱、分光 光度计
移液器
1.调刻度 2.取样 注意：加不同物质换 枪头
实验材料与仪器
试剂盒：
1.混合液：磷酸苯二钠、4-氨基安替比林 2.标准液：已知浓度的酚溶液 3.样 品：血清 4.蒸馏水 5.显色剂:高铁氰化钾
生物化学与分子生物学实验
血清碱性磷酸酶活性测定
授课教师：
实验目的
1.学习血清碱性磷酸酶活性测定 的原理及方法 2.了解血清碱性磷酸酶活性测定 的临床意义
基本概念
酶活性：即酶催化化学反应的能力。
酶的活性通常以活性单位表示。
它反映在规定的条件下，酶促反应 在单位时间内（秒、分或小时）生 成一定量的产物（mg、μg 、μmol） 或消耗一定量的底物所需的酶量。
——呆小病、磷酸酶过少症、维生素C缺 乏症等。
Katal单位：1Katal指在规定条件下， 每秒钟转化1mol底物的酶量。 1Katal=60×106IU
本实验以血清在37℃，pH为10的
条件下，与AKP底物液作用30min， 每生成1mg酚所需的酶量为1个酶
活性单位。
实验原理
碱性磷酸酶（AKP）在碱性条件下
催化磷酸苯二钠水解，释放出酚和
磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安
基本概念
酶活性单位是衡量酶数量的尺度， 同一种酶由于实验方法、测定条件 不同，酶活性单位的规定也不同。
在相同测定条件下，酶活性单位越 大，表示酶的含量越高，酶促反应 速度越快。
血清中碱性磷酸酶的测定
果。
误差分析
误差来源识别
分析测定过程中可能存在的误差来源，如试剂不稳定 性、操作不规范等。
误差评估
对误差进行定量评估，了解误差对测定结果的影响程 度。
误差控制
采取相应的措施控制误差，如定期校准仪器、规范操 作流程等，以提高测定结果的准确性和可靠性。
05 结论
CHAPTER
实验总结
实验原理
本实验基于碱性磷酸酶在pH值为9.6 的磷酸盐缓冲液中，能够将磷酸苯二 钠水解为苯酚和磷酸，苯酚在硫酸的 作用下可以形成稳定的苯酚钠盐，进 而通过分光光度计测定其吸光度，从 而计算碱性磷酸酶的活性。
02
探索其他相关指标与碱性磷酸酶的关联性，以更全面地评估肝
胆疾病的病情和治疗效果。
针对实验中的关键步骤和影响因素进行深入研究，以提高实验
03
的准确性和可靠性。
谢谢
THANKS
测定方法分类
根据测定原理，碱性磷酸酶的 测定方法可分为化学法和生物 法两类。
化学法包括酚试剂法、磷酸苯 二钠法等；生物法包括利用同 工酶的电泳法和免疫法等。
其中，酚试剂法由于操作简便、 准确度高，是目前临床上最常 用的测定方法。
03 实验步骤
CHAPTER
样本采集与处理
采集血清样本
从患者静脉采血，分离出血清， 避免溶血和污染。
数据转换
根据需要，将测量值转换为相应 的浓度或活性单位，以便进行比 较和解释。
结果判断与解读
正常范围判断
01
根据参考值范围，判断血清中碱性磷酸酶的活性是否在正常范
围内。
异常结果解读
02
对于异常结果，应结合临床情况和相关指标进行分析，以确定
可能的病因或病理状态。
实验二 碱性磷酸酶的提取及其比活性测定
二、实验原理
1、 AKP概述
① 催化有机单磷酸酯水解，并有转移磷酸基的作用 ②最适pH：8.6～10.3 ③ 特点：特异性低
④体内位置：细胞膜表面 -肾小管的筛状缘 -肠粘膜的微绒毛 -胆小管的细胞膜缘 -肝窦状腺表面 -胎盘合体细胞滋养层细胞外表面
⑤正常血清： ALP主要来自肝（或胆管）和骨骼，约各占总活性 的一半。
弃沉淀
上清入回收瓶
沉淀
加 0.01M Mg(Ac)2- 0.01 M NaAc
Vc 混合液4ml ，搅拌，记体积
C液
C1管
0.10ml C 液 + 1.9 ml 0.01M pH 8.8 Tris
（待测酶活性）
C2管
剩余C液Vc'
0.1 ml C液 + 0.4 ml 生理盐水
加0.5Vc'冷丙酮→ 33% ， 混匀,离心 2000 rpm ,5 分钟
⑥临床意义：血清ALP活力增高常见于 -肝胆疾病（胆道阻塞等） -骨骼疾病（佝偻病等） -甲状腺功能亢进 -妊娠和生长期儿童
2、AKP的分离、提取、及纯化
整个制备过程可分为 5 个阶段： ①材料的选择和预处理， ②细胞的破碎， ③提取， ④纯化（包括盐析、有机溶剂提取、层析、电泳
等）， ⑤浓缩、干燥及保存。
通过离心，去除 部分杂蛋白
③ 丙酮
33% AKP 溶解状态 50% AKP 沉淀状态
通过离心，进一 步去除杂蛋白
④ 保护酶活性措施
a. 低温条件下操作 b. 所有试管均需洗干净 c. 选择合适的pH及合适的缓冲体系，以稳
定酶活性
保护和稳定AKP
Mg(Ac)2 ~ NaAc 混合液提取AKP pH 8.8 Tris 缓冲液测AKP活性
碱性磷酸酶比活力测定
（二）、酶活力
在37C下，以5mmol/L pNPP为底物，在pH 10.1的
碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg2+的测活体系中每分
钟催化产生1 mol/L pNP的酶量定为1个酶活力单 位。
酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位 数。
酶活性测定前处理
1、2号样品稀释50倍（用洗脱液稀释） 3号样品稀释20倍（用洗脱液稀释） 4号样品不稀释（用洗脱液稀释）
3. 物质浓度，液层厚度与光吸收的关系 （Lambert--Beer定律）：
当一束单色光通过溶液后，光被溶液吸收的程度（D） 与溶液的浓度（C），液层的厚（L）以及入射光的强度 （I0）有关。溶液浓度越大，液层越厚，吸光越多，这 就是物质（均匀透明固体，液体，气体）对光的吸收定 律。
4. 待测溶液浓度的计算：
蛋白浓度按下式计算：
100g / mL牛血清白蛋白 ＝ C未知
OD280
OD280
数据处理
单位时间0.1mL酶液催化产物量计算： 克分子消光系数法
PNP 1 mol / L(1cm光程)＝C未知
OD40（5 8.8 103）
OD即Βιβλιοθήκη C未知＝OD/(8.8103)
计算：
酶活力(U/mL) = B t V1
（3）消光系数法：
1%浓度，1cm厚度溶液中测得：K = E1cm1% 或１克分子浓度，１cm厚度溶液中测得：K = ξ C = D/E1cm%, 或 C = D/ξ
常用于紫外吸收法测定蛋白质，核酸含量，二者分 别在280nm和260nm处有最大吸收，其消光系数 可查到，在同样条件下，测定待测溶液的光密度, 带入上式即可求得C。
（1）标准管法：
在同样条件下，测得标准液和待测液的光密度（D） 值，然后计算：
血清中碱性磷酸酶的测定
混匀。37°C水浴保温5min，同时将底物液预热 底物液／ml 1.00 1.00 1.00 1.00
混匀。 37°C水浴保温15min 铁氰化钾溶液／ml 血清／ml 3.00 － 3.00 － 3.00 － 3.00 0.100
计算公式： 计算公式：
ALP的活力＝（ A测定－A 位）
对照）／（A标准－A空白）ห้องสมุดไป่ตู้0.15×100（Kings单
2生成的酚化合物本身在一定的条件下就可显色如磷酸对硝在在ph10ph10的环境中的环境中alpalp催化磷酸二苯钠的水解生成苯酚催化磷酸二苯钠的水解生成苯酚和磷酸氢二钠苯酚与和磷酸氢二钠苯酚与44氨基安替比林反应生成色素原该色氨基安替比林反应生成色素原该色素原经铁氰化钾氧化生成红色醌亚胺衍生物
血清中碱性磷酸 酶活性的测定 磷酸苯二钠法） （磷酸苯二钠法）
实验器材与试剂
• （一）器材 器材
5ml移液管、100ul或微量可调式移液器、721E型分光光度计、1cm比色 皿、37℃恒温水浴锅。
• （二）试剂 试剂
（1）0.1mol/L碳酸缓冲液（pH=10.0)：称取无水碳酸钠6.36g、碳酸氢钠 3.36g、4-氨基安替比林1.5g，溶于800ml蒸馏水中，定容至1L,置于棕色 瓶内储存。 （2）20mmol/L磷酸苯二钠溶液：先将500ml蒸馏水煮沸，迅速加入磷酸苯 二钠2.18g（磷酸苯二钠如含2分子结晶水，应称取2.54g)，冷却后加氯 仿2ml防腐，在4℃冰箱内保存。用剩的溶液不应再倒回瓶中。 （3）铁氰化钾的硼酸溶液：称取铁氰化钾2.5g、硼酸17g，各溶于400ml 蒸馏水中，两液混合后，加蒸馏水至1L，置于棕色瓶内避光保存。如出 现蓝绿色，说明试剂变质，应弃去。 （4）酚标准工作液（0.05mg/ml):购买合格的二级标准品。
血清碱性磷酸酶活性测定
检测方法的准确性评估
参考方法：国际标 准或国家标准的血 清碱性磷酸酶活性 测定方法
准确性评估指标： 回收率、精密度、 线性范围、干扰因 素等
准确性评估方法： 与参考方法进行比 对，或与其他实验 室进行比对
操作规程标准化：制定标准化的操作规程，确保检测过程的规范性和一致性。
室内质量控制：通过定期进行室内质量控制，监控检测过程的稳定性和准确性，及时发现 并纠正误差。
实验室间质量控制
定期进行实验室间比对实验，确 保不同实验室间的检测结果具有 可比性。
对实验室内部质量控制数据进行 分析，及时发现和解决潜在问题。
检测方法的标准化
检测方法的标准化是确保血清碱性磷酸酶活性测定准确性和可靠性的关键步骤。
标准化包括使用统一的仪器设备、试剂和操作程序，以及定期对标准品进行校准等。
标准化可 标准化对于血清碱性磷酸酶活性测定的临床应用和科学研究具有重要意义。
检测方法的临床应用范围
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参与权威机构组织的质控活动， 获取质控样品并按照要求进行检 测。
关注国内外质量控制动态，更新 质量控制方法和标准。
质量控制的监测指标
精密度：测定结果的重复性和稳 定性
灵敏度：检测低浓度样本的能力
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准确度：测定结果与真实值的接 近程度
抗干扰能力：抵抗非特异性物质 干扰的能力
药物使用：某些药物可能影响血 清碱性磷酸酶活性。
药物因素
药物种类：不 同药物对血清 碱性磷酸酶活 性的影响不同
碱性磷酸酶Km值的测定-毕业论文-
12
mmol/L
78
16
0
1/[S] 1 0.333 0.200 0.167 0.125 0.083 0.063 1/OD
2、作图
■ 以 [s ]为横轴，OD510为纵横作图，观 察曲线形状；查Km值
■ 以1／［s]为横轴，1／OD510为纵轴作图 观察曲线形状；查Km值
■ 比较两个值的差异.
OD510
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 底物液 0.05 0.15 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80 0
(0.04M)
碳酸缓 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0
液(pH=10)
蒸馏水 0.95 0.85 0.75 0.70 0.60 0.40 0.20 1
■ 本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其 底物，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨 基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌 的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低 其反应式如下：
磷酸苯二钠+H2O Fra bibliotekKP OH- 苯酚
苯酚+4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 醌衍生物 （红色）
【实验操作】
碱性磷酸酶Km值 的测定
【实验目的】
■ 1 . 了解酶的Km值测定原理和方法
■ 2．掌握碱性磷酸酶（AKP）活性 测定的原理和方法
【实验原理】
■ 在温度，PH及酶浓度恒定的条件下，酶促 反应的初速度随底物浓度（S）增大而增加 但当底物浓度增大到一定极限时，则反应 速度趋于恒定，此最大反应速度Vmax，反 应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方 程来表示，即：
1/OD510
VMAX
碱性磷酸酶活性测定试剂盒说明书
碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP/ALP）活性测定试剂盒说明书分光光度法50管/24样注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：AKP/ALP是一种含锌的糖蛋白酶，在碱性环境中可水解各种天然及人工合成的磷脂单酯化合物。
AKP/ALP 广泛分布于人体各脏器中，以肝脏为主。
测定原理：在碱性环境中，AKP/ALP催化磷酸苯二钠生成游离酚；酚与4-氨基安替比林和铁氰化钾反应红色亚醌衍生物，在510nm有特征光吸收；通过测定510 nm吸光度增加速率，来计算AKP活性。
自备仪器和用品：可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。
试剂组成和配制：试剂一：液体×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体×1瓶，4℃避光保存。
试剂三：液体×1瓶，4℃避光保存。
试剂四：液体×1瓶，4℃避光保存，未变成蓝绿色之前均可使用。
标准品：液体×1支（EP管中），2 μ mol/mL酚标准液，4℃保存。
粗酶液提取：1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，4℃、8000g离心10min，取上清液待测。
2. 细菌或细胞：按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3. 血液可直接测定，或者适当稀释后测定。
测定步骤：1. 分光光度计预热30min，调节波长到510 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂三置于37℃水浴中预热30 min。
3. 空白管：取EP管，加入20μL蒸馏水，200μL试剂二，200μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；加入试剂四600μL，混匀后于510 nm测定吸光度，记为A空白管。
血清碱性磷酸酶ALP测定
血清碱性磷酸酶ALP测定1.实验原理ALP对硝基酚磷酸盐+ H2O —————→磷酸+ 对硝基酚Mg2+在镁离子存在下, 对-硝基酚磷酸盐被ALP分解成磷酸和对-硝基酚,在405nm 的波长下, 对-硝基酚的吸光度增加与ALP的活性成正比。
2. 标本：2.1 病人准备：新鲜血清，采血后应及时分离，避免溶血。
2.2 类型：血清、肝素或EDTA血浆，应避光保存。
3. 标本存放：15～25℃保存可稳定2天；2～8℃保存可稳定7天；-20℃保存可稳定3个月，如冰冻保存，不可反复冻融！。
4. 标本运输：冰冻条件下保存运输。
5. 标本拒收标准：标本溶血、细菌污染、脂血等存运输的标本。
6. 实验材料6.1 试剂：中生碱性磷酸酶试剂盒（试剂1＋试剂2）6.1.1 试剂组成6.1.3 试剂稳定性与贮存试剂避光保存于2～8℃，若无污染，可稳定至失效期。
试剂有效期为12个月。
试剂必需避光保存。
试剂不可冰冻。
6.1.4 变质指示：当试剂空白吸光率A405nm(1.0cm)>1.0，或有混浊和可见颗粒时，请不要再使用。
6.1.5 注意事项：试剂请勿直接接触皮肤、眼睛，如有接触，请用大量清水清洗。
请勿吞服。
6.2 校准品：使用OLYMPUS提供的多项校准品对自动分析仪进行校准，参见生化检验校准品和质控品.SOP文件6.3 质控品：参见生化检验校准品和质控品.SOP文件7. 仪器：奥林巴斯AU640生化分析仪8. 操作步骤8.1 项目基本参数：参见生化检验奥林巴斯AU640生化分析仪项目测定参数.SOP文件。
8.2仪器操作步骤：参见生化检验奥林巴斯AU640生化分析仪操作规程.SOP 文件。
9. 检验结果的判断与分析10. 质量控制：在每一批标本中都应把非定值血清水平I与II质控做为未知标本进行分析，以2S为质控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控。
质控规则参见生化室室内质控操作规程.SOP文件。
11. 计算方法：以OLYMPUS校准品校准仪器后，在病人结果可报告范围内，仪器直接报告可靠的检测结果无需手工计算，以U/L报告。
血清碱性磷酸酶测定标准操作规程
血清碱性磷酸酶测定标准操作规程1.检验原理：(对硝基酚磷酸盐连续监测法)以磷酸对硝基酚二钠(PNPP)为底物，2—氨基-2-甲基丙醇(AMP)为磷酸酰基的受体。
在碱性环境，碱性磷酸酶催化PNPP水解产生的游离对硝基酚，对硝基酚在碱性溶液中转变成黄色。
根据在405nm 处吸光度增高速率来计算碱性磷酸酶的活性单位。
PNPP+H2O9阻'->对硝基酚+无机磷-20°C保存7天，样本不可反复冻融！4.检验方法；仪器法(详见DF-603/DI-600标准操作规程)5.参考范围6.检验结果的解释：6.1样本含量超出线性范围时，建议用0.9%(W∕V)的氯化钠溶液稀释样本。
7.2.单位换算：ukat∕L=U∕L*16.67*IO-38.检验方法的局限性8.1结果的准确性依赖于仪器的校正和测定温度、时间的控制。
7.2若试剂浑浊或以水空白在405nm处吸光度大于1.000时不能使用。
8.试剂性能指标8.1试剂外观：R1：无色透明液体，无悬浮物及沉淀；R2无色或淡黄色透明液体，无悬浮物及沉淀。
8.2装量：不低于标识值。
8.3空白吸光度：在37℃、405rπn处，光径IenI时，空白吸光度A≤1.0008.4空白吸光度变化率：在37C、405nm处，光径ICm时，用生理盐水作为样品加入试剂测试时，Z∖A∕minW0.005.1.15分析灵敏度：在405nm处,光径Icm时，测量120U/L的碱性磷酸酶时，吸光度变化4A∕min20.015.8.6线性范围：试剂的线性区间为[25-750]U∕L,在此线性区间内：a)线性相关系数r应不小于0.9900；b)[25-100]U/L区间内，线性绝对偏差不超过土10U/L；(100-750)U/L区间内,线性相对偏差不超过±10%。
8.7重复性:CV≤5%8.8批间精密度:R≤10%8.9准确度：相对偏差应不大于±10%。
8.10稳定性：(2-8)C下，原包装存放的试剂有效期为12个月,取到期后一个月的试剂进行测试，应满足1-7、9的要求。
血清中碱性磷酸酶活力的测定
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碱性磷酸酶值测定实验报告
碱性磷酸酶值测定实验报告一、实验目的碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，简称 ALP）是一种广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。
本次实验的目的是测定样本中碱性磷酸酶的活性，以评估相关生理或病理状态。
二、实验原理碱性磷酸酶在碱性环境下能够催化磷酸酯的水解反应，生成无机磷和醇。
通过测定生成的无机磷的量，可以间接反映碱性磷酸酶的活性。
本实验采用磷酸苯二钠法，磷酸苯二钠在碱性条件下被碱性磷酸酶水解生成苯酚和磷酸氢二钠。
苯酚与 4-氨基安替比林反应生成红色醌亚胺衍生物，在 510nm 波长处有最大吸收峰。
通过测定吸光度值，并与标准曲线对照，即可计算出碱性磷酸酶的活性。
三、实验材料与设备1、材料血清样本磷酸苯二钠溶液碳酸盐缓冲液（pH 100）4-氨基安替比林溶液铁氰化钾溶液酚标准液2、设备分光光度计恒温水浴锅移液器试管、刻度吸管等四、实验步骤1、标准曲线的绘制取 6 支干净试管，分别编号为 0、1、2、3、4、5。
按表 1 向各试管中加入试剂，混匀。
置于 37℃水浴中保温 15 分钟。
加入铁氰化钾溶液 30ml，立即混匀。
用分光光度计在 510nm 波长处，以 0 号管调零，读取各管的吸光度值。
以酚含量（μg）为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
表 1 标准曲线绘制的试剂加入量｜试管编号|0|1|2|3|4|5|｜｜｜｜｜｜｜｜｜酚标准液（ml）｜0|005|010|020|030|040|｜蒸馏水（ml）｜10|095|090|080|070|060|｜碳酸盐缓冲液（ml）｜30|30|30|30|30|30|｜4-氨基安替比林溶液（ml）｜10|10|10|10|10|10|｜铁氰化钾溶液（ml）｜30|30|30|30|30|30|2、样本测定取 3 支干净试管，分别编号为测定管、对照管和空白管。
按表 2 向各试管中加入试剂，混匀。
置于 37℃水浴中保温 15 分钟。
碱性磷酸酶米氏常数及活性的测定
[结果与计算] 在37℃保温15分钟，每生成1mg酚为一个酶 活性单位，以标准曲线查出释放酚量(μg)即可 算出酶活性。
100mL血清中酶活性 = 释放的酚量×（1/0.1）×100× （1/1000）=释放的酚量（μg） （释放酚量（μg）、1/0.1--0.1为实际取血清0.1ml、 100为100ml血清、1000为μg变为mg。）
此式为直线方程，以不同的底物浓度1/[S]为横坐 标，以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方 向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/ Km，由此可以 正确求得该酶的Km值，如图所示。
本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度 的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图，计算 其Km值。 可以作为碱性磷酸酶底物的物质很多，底物反 应的酶对于不同的底物有不同的Km值。本实验以磷 酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游 离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林 作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜 色深浅和酚的含量成正比。根据吸光度的大小可以 计算出酶的活性，也可以从标准曲线上查知酚的含 量，进而算出酶活性的大小。反应式如下：
三、[试剂与器材] 1．0.04mol/L 基质液 2．0.1mol／L碳酸盐缓冲液pH10(37℃) 3．碱性溶液 4．0.5％铁氰化钾 5．0.3％ 4-氨基安替比林 6．酚标准液(0.1mg/mL) 7．37℃恒温水浴锅 8．可见光分光光度计
四、[操作步骤] 1．酚标准曲线的绘制 ：
酚含量（μg）：
(4)各管分别加入0.3％ 4-氨基安替比林 1.OmL，0.5％ 铁氰化钾2.0mL，充分混 匀，放置10分钟，以6号空白管作对照， 于510nm波长处比色测定，根据酚标准 曲线计算酶活性。 (5)以各管基质浓度的倒数1/[S]为横坐 标，以各管吸光度的倒数或者以酶活性 单位的倒数1/V作纵坐标，作图求出Km 值。
碱性磷酸酶比活性测定实验报告
碱性磷酸酶比活性测定实验报告一、实验目的本实验旨在测定碱性磷酸酶（ALP）的比活性，了解其在生物体内的作用和活性水平。
通过实验，掌握碱性磷酸酶比活性测定的基本原理和方法，培养实验操作技能和数据处理能力。
二、实验原理碱性磷酸酶是一种广泛存在于生物体内的酶，能够催化磷酸酯的水解反应。
在本实验中，以对硝基苯磷酸二钠（pNPP）为底物，在碱性条件下，碱性磷酸酶能够将 pNPP 水解生成对硝基苯酚（pNP）和磷酸。
pNP 在碱性溶液中呈黄色，其在 405nm 波长处有最大光吸收。
通过测定反应体系在405nm 处的吸光度变化，可以计算出碱性磷酸酶的活性。
比活性是指每毫克蛋白质所含的酶活性单位数，通过测定蛋白质含量和酶活性，即可计算出碱性磷酸酶的比活性。
三、实验材料与仪器1、实验材料碱性磷酸酶标准品对硝基苯磷酸二钠（pNPP）碳酸钠碳酸氢钠缓冲液（pH 100）氢氧化钠溶液（1mol/L）考马斯亮蓝 G-250 试剂牛血清白蛋白标准品待测样品（组织提取液或细胞培养液）2、实验仪器分光光度计离心机恒温水浴锅移液器容量瓶试管四、实验步骤1、标准曲线的绘制配制不同浓度的对硝基苯酚（pNP）标准溶液：分别吸取 0、01、02、03、04、05ml 的 1mmol/L pNP 标准溶液，加入到 10ml 容量瓶中，用碳酸钠碳酸氢钠缓冲液定容至刻度，得到浓度为 0、10、20、30、40、50μmol/L 的标准溶液。
长处测定各标准溶液的吸光度。
绘制标准曲线：以 pNP 浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2、蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝法）配制考马斯亮蓝 G-250 试剂：将 100mg 考马斯亮蓝 G-250 溶解于50ml 90%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，最后用蒸馏水定容至1000ml。
配制牛血清白蛋白标准溶液：将牛血清白蛋白标准品用蒸馏水配制成 0、01、02、03、04、05mg/ml 的标准溶液。
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实验原理
三.核心原理 ALP催化磷酸苯二钠转变成苯酚的速率 可用分光光度计监测，从而计算ALP活 力的大小 ALP 磷酸苯二钠+H2O----------苯酚+磷酸氢 PH 10 二钠 苯酚+4-氨基安替比林--铁氰化钾---红色醌 亚胺衍生物
试剂
碳酸盐缓冲液（0.1mol/L PH10.0) 无水碳 酸钠6.36g、碳酸氢钠3.36g、4-氨基安替比 林1.5g溶于800ml蒸馏水中，定容至1L。棕 色瓶贮存。 磷酸苯二钠底物液（20mmol/L) 先将 500ml蒸馏水煮沸，迅速加入磷酸苯二钠 2.18g，冷却后加氯仿2ml，4℃冰箱保存。 显色液 铁氰化钾K3[Fe(CN)6]2.5g、硼酸 17g，各溶于400ml蒸馏水，混合后加蒸馏 水至1L，棕色瓶避光保存。 酚标准工作液0.05mg/ml
实验操作
试剂/ml 血液 酚标准液 蒸馏水 PH10碳酸盐 缓冲液 底物液 铁氰化钾溶 液 血清 测定管（T） 0.100 ----1.00 标准管（S) --0.100 --1.00 空白管（B） 对照管（C） ----0.100 1.00 ------1.00
混匀，37℃水浴保温5min，同时将底物液预热
临床意义
1.生理性增加：如儿童、妊娠期、进食 高糖高脂肪食物等使ALP活性升高 2.病理性改变 A.升高：肝胆疾病（主要见于阻塞性黄 疸，急或慢性黄疸型肝炎，肝硬化，肝 癌） 骨骼疾病（纤维性骨炎、变型 性骨炎、成骨不全症、骨质软化病、佝 偻病、肿瘤骨转移等） B.降低:主要见于呆小症、磷酸酶过少症 等
血清碱性磷酸酶活力的测定
磷酸苯二钠法
生化试验第三组
实验目的
1.熟悉酶活力测定方法的一般原理 2.掌握血清碱性磷酸酶(ALP)的测定原理 与临床意义。 3.酶活力测定的目的是了解组织提取液、 体液中酶的存在于含量。
实验原理
一.基本概念 1.酶活力测定 酶的催化功能可以用在一定条件下 酶所催化的某一特定化学反应的速度来表示。反 应速度越快，酶活力越高;反之，活力越低。测定 酶活力实际上是测定酶促反应速率。 2.酶的活力单位 a.国际 在特定的条件下，1min内将1μmol底物转 化为产物所需的酶量为1个国际单位(IU)。 1IU=16.67×10-9Katal b.临床上采用金氏（Kings）的定义：每100ml血清 在37℃与底物作用15min，产生苯酚1mg的酶量为1 个金氏单位。 c.Kat单位 在特定条件下，每秒钟转化1mol底物的 酶量。1Kat=6×107 IU
1.00 3.00 --1.00 3.00 --1.00 3.00 --1.00 3.00 0.100 混匀，37℃水浴保温15min
立即混匀，在510nm波长处比色，以蒸馏水调零点，读取各管吸光度
计算公式
注意事项
1.铁氰化钾应避光保存，如出现蓝绿色 即作废。铁氰化钾 的水溶液受到光线 的作用，就会分解成黄血盐钾 K4[Fe(CN)6] 2.底物液中不应含有酚，如含有酚时空 白管显红色，说明磷酸苯二钠开始分解， 不宜继续使用 3.加入铁氰化钾后必须迅速混匀，否则 显色不充分
思考
结合参考值范围、临床意义分析本小组 的实验结果
实验原理
二.测定方法 1.终止测定法（定时法或终点法）是当 酶促反应进行到一定时间点，通过物理 或化学方法(强酸、强碱、蛋白沉淀剂） 终止反应。 动力学分析法（连续监测法或速率法） 在酶促反应过程中，用仪器连续监测酶 促反应产物或底物的变化量，通过计算 求出酶的活性。
实验原理
测定ALP活力分两种 1.测定底物解离下的磷酸根来计算。如 β-甘油磷酸钠法，但存在血清本身有磷 酸根的缺点。 2.测定底物解离后的羟基化合物 A.在显色剂的作用下显色比色测定（本 次） B.生成的酚化合物本身在一定条件下就 可以显色（对硝基苯磷酸二钠法）